Evaluación de la capacidad inmunogénica de epítopes transplantados en la superficie de proteínas séricas: hacia el desarrollo de nuevas vacunas epitópicas

Abstract

Las vacunas más importantes en la actualidad las constituyen principalmente proteínas recombinantes, las cuales se caracterizan por una rápida degradación y corto tiempo de circulación, por lo que su exposición al sistema inmune se limita a períodos breves. En ese sentido, múltiples dosis y refuerzos son necesarios para compensar esta limitación. Más recientemente se vienen probando con éxito las denominadas vacunas peptídicas, péptidos correspondientes a epítopes inmunogénicos/protectivos que se sintetizan químicamente y son administrados en varias dosis. Los epítopes son la porción clave de una proteína responsable de la inducción de inmunidad y protección. El uso de múltiples epítopes constituyen las denominadas vacunas multiepitópicas, las cuales fundamentalmente consisten de arreglos lineales de epítopes inmunogénico/protectivos unidos químicamente a la superficie de proteínas solubles que sirven de transportadores. Es importante remarcar que en este tipo de vacunas no se considera la estructura tridimensional de los péptidos, quedando éstos orientados básicamente de manera aleatoria sobre la superficie de la proteína transportadora sin mantener una estructura tridimensional estable. El presente estudio demostraría una nueva estrategia para el transporte de epítopes inmunogénicos utilizando proteínas séricas grandes y estables (de largo tiempo de vida media en circulación), como la albúmina sérica. El objetivo principal fue prolongar el tiempo de vida media de los epítopes en circulación, y lograr que en su exposición al sistema inmune se asemeje lo más cercanamente posible a lo que sucede cuando el epítope forma parte de la proteína patógena, es decir lograr que la estructura tridimensional de los epítopes se conserve. Para ello, se seleccionó un epítope inmunogénico que fue “transplantado” sobre la superficie de una proteína sérica, como la albúmina, sin perturbar su estructura tridimensional original. Con esta “cirugía molecular” asistida por herramientas bioinformáticas de modelamiento y biología molecular se logró transplantar un epítope inmunogénico sobre la superficie de una proteína sérica propia del organismo a ser inmunizado, para crear una proteína inmunogénica transformada con características especiales y convenientes. El diseño molecular cuidadoso de esta proteína transformada otorgó al epítope seleccionado un ambiente que le permitió la adopción de una estructura tridimensional y una orientación hacia el solvente, similar a aquella que tiene el epítope cuando forma parte de la proteína patógena nativa. El modelo utilizado para comprobar la ´prueba de concepto´ de esta estrategia fue la hemaglutinina del virus influenza A, la proteína viral utilizada como vacuna contra esta infección. Para lograr este ´transplante molecular ´del epítope se identificó mediante herramientas bioinformático–estructurales, dominios localizados en la superficie de la proteína sérica ´receptora que tenían una estructura tridimensional similar a la correspondiente al epítope cuando éste forma parte de la proteína patógena nativa. Con técnicas moleculares, el dominio más apropiado fue removido y reemplazado por el epítope inmunogénico. Se expresó de manera recombinante una albúmina de ratón transplantada con uno de los epítopes inmunogénicos de la hemaglutinina del virus influenza A, previamente seleccionado. Se inmunizó ratones con la albúmina transplantada y con otras formas de presentación del mismo epítope: conjugado químicamente a la albúmina de ratón recombinante, mezclado en solución con la albúmina recombinante, y el epítope aislado; y se determinó la capacidad productora de anticuerpos anti-epítope estimulada por cada forma de presentación del epítope. El presente estudio demostraría la ´prueba de concepto´ de que un epítope transplantado sobre la superficie de una proteína sérica podría ser capaz de elucidar una respuesta inmune superior a la obtenida por el epítope aislado o por el epítope conjugado químicamente a la proteína sérica transportadora mediante una producción de anticuerpos anti-epítope significativamente mayor, y que además se incrementa en el tiempo. Así mismo, luego de una exposición tiempo después al mismo epítope se logra estimular la producción de anticuerpos anti-epítope de memoria lo que sugiere que el epítope transplantado en la proteína sérica transportadora no solo estimularía una mayor respuesta humoral sino también inmunidad de memoria.

The most important vaccines today are mainly recombinant proteins, which are characterized by rapid degradation and short circulation times, so their exposure to the immune system is limited to short periods. In that sense, multiple doses and boosters are necessary to compensate for this limitation. More recently, so-called peptide vaccines, peptides corresponding to immunogenic / protective epitopes that are chemically synthesized and administered in various doses, have been tested with success. Epitopes are the key portion of a protein responsible for the induction of immunity and protection. The use of multiple epitopes constitutes the so-called multiepitopic vaccines, which mainly consist of linear arrays of immunogenic / protective epitopes chemically bound to the surface of soluble proteins that serve as transporters. It is important to note that in this type of vaccines the three-dimensional structure of the peptides is not considered, leaving them oriented basically randomly on the surface of the carrier protein without maintaining a stable three-dimensional structure. The present study would demonstrate a new strategy for the transport of immunogenic epitopes using large and stable serum proteins (with a long circulating half-life), such as serum albumin. The main objective was to prolong the half-life of the epitopes in circulation, and to achieve that in its exposure to the immune system it resembles as closely as possible what happens when the epitope is part of the pathogenic protein, that is, to achieve that the three-dimensional structure of the epitopes is preserved. For this, an immunogenic epitope was selected that was "transplanted" onto the surface of a serum protein, such as albumin, without disturbing its original three-dimensional structure. With this "molecular surgery" assisted by bioinformatic modeling and molecular biology tools, it was possible to transplant an immunogenic epitope on the surface of a serum protein of the organism to be immunized, to create a transformed immunogenic protein with special and convenient characteristics. The careful molecular design of this transformed protein gave the selected epitope an environment that allowed it to adopt a three-dimensional structure and an orientation towards the solvent, similar to that of the epitope when it is part of the native pathogenic protein. The model used to verify the 'proof of concept' of this strategy was the hemagglutinin of the influenza A virus, the viral protein used as a vaccine against this infection. To achieve this 'molecular transplantation' of the epitope, domains located on the surface of the serum receptor protein were identified using bioinformatic-structural tools, which had a three-dimensional structure similar to that corresponding to the epitope when it is part of the native pathogenic protein. . With molecular techniques the most appropriate domain was removed and replaced by the immunogenic epitope. A mouse albumin transplanted with one of the previously selected immunogenic epitopes of the influenza A virus haemagglutinin was expressed recombinantly. Mice were immunized with the transplanted albumin and with other forms of presentation of the same epitope: chemically conjugated to the recombinant mouse albumin, mixed in solution with the recombinant albumin, and the isolated epitope, and the ability to produce anti-epitope antibodies was determined stimulated by each form of presentation of the epitope. The present study would demonstrate the ´proof of concept´ that an epitope transplanted on the surface of a serum protein could be capable of elucidating an immune response superior to that obtained by the isolated epitope or by the epitope chemically conjugated to the transporter serum protein by means of a significantly higher production of anti-epitope antibodies, which also increases over time. Likewise, after an exposure time later to the same epitope, it is possible to stimulate the production of anti-memory epitope antibodies, which suggests that the transplanted epitope in the serum transport protein would not only stimulate a greater humoral response but also memory immunity.