Estandarización de una prueba basada en PCR-RFLP del gen HMTp210 para la tipificación molecular de Avibacterium paragallinarum

Abstract

Avibacterium paragallinarum es el agente etiológico de la coriza infecciosa en pollos y gallinas (Gallus gallus) y está clasificado serológicamente en 3 serogrupos y 9 serotipos, mediante la prueba de inhibición de la aglutinación. Debido a que la coriza infecciosa genera pérdidas económicas por retraso del crecimiento, pérdida de peso, incremento en el número de aves eliminadas y predisposición a la enfermedad respiratoria crónica complicada, es de importancia desarrollar una prueba molecular que permita tipificar con precisión y rapidez a A. paragallinarum, teniendo como objetivo de esta investigación estandarizar una prueba basada en PCR-RFLP para la tipificación molecular de Avibacterium paragallinarum. Por medio del análisis bioinformático, se diseñaron un conjunto de cebadores que amplificaron un producto de 1,5 kb de la región 2 del gen HMTp210, específicos a las cepas de referencia de A. paragallinarum; posteriormente, se seleccionaron las enzimas de restricción BtgI, BtgZI y KasI para la prueba RFLP y finalmente se seleccionaron los perfiles de restricción. Mediante la estandarización de la PCR se determinó que el límite de detección fue de 103 copias/µl, la temperatura de alineamiento óptima fue de 58 °C y la concentración de cebadores ideal se estimó en 0.1 µM. Se evaluaron nueve controles sintéticos y trece cepas bacterianas de A. paragallinarum donde se obtuvo perfiles de restricción únicos para cada variedad de A. paragallinarum y donde de las trece cepas se identificaron tres del tipo B-1, dos del tipo A-1, dos del tipo C-1 y uno de los seis tipos restantes. En conclusión, la PCR-RFLP utilizando la región 2 del gen HTMp210 es un método alternativo que permite identificar las tipos de A. paragallinarum y presenta múltiples ventajas respecto a las pruebas convencionales.