Purificación del dímero Septina 5 (SEPT5) ~ Septina 8 (SEPT8)

Abstract

Las septinas (SEPT) son GTPasas involucradas en una amplia gama de procesos biológicos que incluyen citocinesis, arquitectura celular, ciliogenesis, apoptosis, etc. Para su función, necesitan ensamblarse en complejos oligoméricos de alto orden como filamentos, anillos o redes. Para estudiar estructuralmente los mecanismos que controlan el correcto ensamblaje se requiere de septinas puras. En la presente investigación se purificó por cromatografía de afinidad a cobalto (Co+2) Septina 5 (SEPT5) y Septina 8 (SEPT8), co-expresadas como un dímero en el sistema E. coli, usando HisTag en el amino-terminal de SEPT8. La purificación se refinó por cromatografía de exclusión molecular para eliminar otras proteínas e imidazol. La pureza de la proteína determinada por SDS-PAGE fue de 95%. La identificación de SEPT5 y SEPT8 se realizó comparando su peso molecular con patrones estándares así como por espectrometría de masas MS-MS, determinando que: SEPT5 pesa 43 kD y SEPT8 56 kD. El rendimiento final obtenido fue de 1.5 mg/ 1L del dímero SEPT5SEPT8. Estas proteínas están aptas para emplearse en ensayos de cristalización del heterodímero SEPT5SEPT8.