Evaluación de herramientas para el control de la fasciolosis bovina: prueba diagnóstica por amplificación isotérmica mediada por bucle y actividad trematicida del extracto de Allium sativum

Abstract

La fasciolosis es una de las parasitosis hepáticas más importantes del país. Actualmente, las principales limitaciones del control de esta enfermedad son el correcto diagnóstico y la progresiva resistencia al triclabendazol, que es el fármaco recomendado para su tratamiento. Por tal motivo, el presente trabajo propone i) desarrollar y evaluar la precisión diagnóstica de LAMP (Loop-Mediated isothermal amplification) aplicando una optimización en la extracción de ADN en heces de bovinos y ii) evaluar la eficacia fasciolicida in vitro de los extractos de ajo. Investigación 1: Estudio donde se desarrolla una nueva prueba LAMP optimizando la extracción de ADN evaluando su precisión diagnóstica. Se optimizó la técnica de extracción de ADN para F. hepatica combinando la técnica coprológica de sedimentación (concentración de huevos de F. hepatica) y la técnica de lisis con perlas de Zirconia/Silica en un homogenizador de alta velocidad a 6m/s durante 40 seg; estas dos técnicas se acoplaron a kits de extracción de ADN comerciales. Para el desarrollo de la prueba LAMP se diseñaron primers específicos para la región ITS-1 optimizando las condiciones de la prueba para ejecutarlo a 60°C por 40 min. Para la evaluación de la precisión diagnóstica de LAMP, se utilizó un diseño de casos y controles colectando 139 muestras de heces de bovinos sacrificados en el “Frigorífico camal San Pedro” en Lurín-Perú. Las muestras se clasificaron como positivas y negativas usando la inspección hepática post mortem y la microscopía de huevos en bilis. LAMP optimizado con la técnica de extracción de ADN logró una sensibilidad del 87.8% (IC 95%: 80.4% - 93.2%) y especificidad del 100 % (IC 95%: 85.8% - 100%), con un likelihood ratio negativo de 0.12 (IC95: 0.08 - 0.19). Investigación 2: Estudio experimental donde se evaluó la eficacia trematicida de extractos de ajos in vitro. Estadios adultos de F. hepatica fueron incubados durante 48 h expuestos a 10 μg/ml de aceite esencial de ajo, 10 μg/ml de extracto acuoso de ajo y 15 μg/ml de triclabendazol sulfóxido usando 112 fasciolas por cada tratamiento. La eficacia se evaluó con el porcentaje de fasciolas totalmente paralizadas por cada grupo. Los adultos de F. hepatica incubados con triclabendazol sulfóxido (15 μg/ml) mostraron un mayor porcentaje de fasciolas paralizadas con respecto al extracto acuoso (16.9 vs 0 %; P<0.002) y aceite esencial (16.9 vs 4.5%; P<0.001). Adicionalmente, se hizo una evaluación de dosis-respuesta determinando que la concentración letal 50 (CL50) del aceite esencial de ajo fue de 0.066 mg/ml, mientras que el CL50 del extracto acuoso de ajo fue de 8.37 mg/ml, estas concentraciones no mostraron efectos citotóxicos. Se concluye que la técnica LAMP con la extracción optimizada de ADN es una prueba diagnóstica sensible y altamente específica para el diagnóstico de la fasciolosis bovina y que el extractos acuoso y aceite esencial de ajo a concentración de 10 μg/ml muestra una actividad fasciolicida in vitro inferior al triclabendazol sulfóxido a 15 μg/ml. No obstante, a mayores concentraciones, los extractos de ajos si evidencian actividad fasciolicida sin actividad citotóxica.

Fasciolosis is one of the most important liver parasitosis in the country. Currently, the main limitations in the control of this disease are the correct diagnosis and the progressive resistance to triclabendazole, which is the drug recommended for its treatment. For this reason, the present work proposes i) to develop and evaluate the diagnostic accuracy of LAMP (Loop-Mediated isothermal amplification) applying an optimization in the extraction of DNA in bovine feces and ii) to evaluate the in vitro fasciolicide efficacy of the extracts of garlic. Investigation 1: Study where a new LAMP test is developed, optimizing DNA extraction, evaluating its diagnostic accuracy. The DNA extraction technique for F. hepatica was optimized by combining the stool sedimentation technique (F. hepatica eggs concentration) and the lysis technique with Zirconia/Silica beads in a high-speed homogenizer at 6m/s for 40 sec; these two techniques were coupled with commercial DNA extraction kits. For the development of the LAMP test, specific primers were designed for the ITS-1 region, optimizing the test conditions to run it at 60°C for 40 min. For the evaluation of the diagnostic accuracy of LAMP, a case-control design was used, collecting 139 fecal samples from bovines slaughtered in the "Frigorífico camal San Pedro" in Lurín-Perú. Samples were classified as positive and negative using postmortem liver inspection and egg in bile microscopy. LAMP optimized with the DNA extraction technique achieved a sensitivity of 87.8% (95% CI: 80.4% - 93.2%) and a specificity of 100% (95% CI: 85.8% - 100%), with a negative likelihood ratio of 0.12. (CI95: 0.08 - 0.19). Investigation 2: Experimental study where the trematicidal efficacy of garlic extracts was evaluated in vitro. Adult stages of F. hepatica were incubated for 48 h exposed to 10 μg/ml garlic essential oil, 10 μg/ml aqueous garlic extract and 15 μg/ml triclabendazole sulfoxide using 112 flukes for each treatment. Efficacy was evaluated with the percentage of totally paralyzed flukes for each group. Adults of F. hepatica incubated with triclabendazole sulfoxide (15 μg/ml) showed a higher percentage of paralyzed flukes with respect to aqueous extracts (16.9 vs 0%; P<0.002) and essential oils (16.9 vs 4.5%; P< 0.001). Additionally, a dose-response evaluation was made, determining that the lethal concentration 50 (LC50) of the essential oil of garlic was 0.066 mg/ml, while the LC50 of the aqueous extract of garlic was 8.37 mg/ml; these concentrations were not showed cytotoxic effects. In conclusion, LAMP technique with optimized DNA extraction is a sensitive and highly specific diagnostic test for the diagnosis of bovine fasciolosis and that the aqueous extracts and essential oil of garlic at a concentration of 10 μg/ml show fasciolicidal activity in vitro lower than triclabendazole sulfoxide at 15 μg/ml. However, at higher concentrations, garlic extracts do show fasciolicidal activity without cytotoxic activity.