Epidemiología molecular de los genotipos de virulencia en cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes dispépticos peruanos

Abstract

Introducción: El adenocarcinoma gástrico se considera la séptima causa de muerte por malignidad en la región las Américas. A nivel nacional, la cancerización del tejido estomacal corresponde a la primera causa de mortalidad asociada con lesiones neoplásicas. Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno común en humanos y responsable de una variedad de enfermedades gastrointestinales como gastritis, ulcera gastroduodenal, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas y cáncer gástrico. La prevalencia de infección por H. pylori en Perú alcanza entre 45% a 83%, observándose que en los últimos 15 años no se ha modificado en los estratos socioeconómicos medio/alto y se ha incrementado en aquellas poblaciones con déficit socioeconómico y carencias de servicios de salud. Según la casuística del Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN) el 89.6% de los casos con adenocarcinoma gástrico presentan la infección por el patógeno H. pylori. La interacción de factores de virulencia presentes en H. pylori promueven cambios moleculares sobre la mucosa epitelial gástrica que se traducen en lesiones de riesgo de desarrollo de cáncer y, es posible que, los tipos de lesiones precancerosas observadas entre pacientes con infección por H. Pylori en Perú se relacionen a marcadores moleculares de virulencia presentes en el genoma de las cepas de H pylori circulantes en nuestro medio, lo que permitiría identificar patrones de riesgo de lesiones gástricas graves entre pacientes con infección por H. pylori. Algunos genes relacionados a factores de virulencia de H. pylori se asocian con el incremento de riesgo de enfermedad neoplásica; tal como, el gen de la citotoxina vacuolizante A (vacA) que codifica para la secreción de la proteína toxigénica VacA, la citotoxina relacionada al gen A (cagA) que confiere una potente actividad proinflamatoria y mitogénica a H. pylori, el gen asociado a ulceración inducido por interacción con el epitelio (iceA) y el gen babA2, de adhesión a antígenos de grupo sanguíneo, que permiten la interacción del patógeno con la superficie de las células gástricas. Pero, los reportes de tipificación del gen cagA son aún insuficientes en nuestro medio y, la detección de genes de virulencia relacionados al gen iceA y al gen babA2, así como, la tipificación y sub-tipificación del gen vacA aún no se ha descrito. Por lo que resulta una necesidad no solo conocer la variabilidad y la distribución de las cepas virulentas de H. pylori en nuestro entorno sino también explorar de forma masiva características moleculares basadas en el viruloma y resistoma de los genomas completos de aislados de H. pylori y su impacto sobre los hallazgos histopatológicos de mucosa epitelial gástrica en pacientes infectados que presentan la lesiones precancerosas tipo metaplasia intestinal. Preguntas de investigación: 1) ¿La lesión precancerosa metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica está asociada a la detección convencional del genotipo cagA(+)/vacAs1am1 en las cepas de Helicobacter pylori aisladas de pacientes dispépticos peruanos?; 2) ¿La lesión precancerosa metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica está asociada a la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 en el genoma completo de cepas aisladas de H. pylori determinada mediante tecnologías de secuenciación de última generación provenientes de pacientes dispépticos peruanos? Métodos: Los datos analizados provienen de un estudio primario conformado por una cohorte de 500 pacientes con dispepsia y cepas aisladas de H. pylori criopreservadas en el biobanco del Laboratorio Centinela de Helicobacter pylori del Instituto de Medicina Tropical Alexander von Humboldt (IMTAvH), enrolados y colectados entre el año 2016 y 2017 en el Servicio de Gastroenterología del Hospital Cayetano Heredia. En la primera investigación, el diseño fue de tipo transversal y utilizo los registros de casos con dispepsia diagnosticados para la infección por H. pylori y sus aislados criopreservados correspondientes. Los aislados procedentes del criobanco fueron reactivados y se extrajo su ADN genómico. En las muestras, se amplificó el ADN de H. pylori mediante PCR convencional para la detección de factores de virulencia del patógeno. Se analizó la asociación entre los estados de enfermedad según gastritis crónica no atrófica y la presencia de lesiones precancerosas tipo metaplasia de los pacientes con infección por H. pylori frente al genotipo de virulencia cagA(+)/vacAs1am1, y mediante un modelo lineal generalizado con enlace log, distribución binomial y varianza robusta, se estimó la razón de prevalencias; también se analizó la asociación de la detección de los motivos EPIYA-A, EPIYA-B y EPIYA-C; los alelos s1, s2, i1, i2, d1, d2, m1, m2 y subtipos s1a, s1b y s1c del gen vacA, los alelos 1 y 2 del gen iceA y el gen babA2 frente al estado clínico de metaplasia intestinal de los casos en estudio. En la segunda investigación, de tipo exploratoria, se utilizó el reporte histopatológico de los casos con infección por H. pylori y sus cepas aisladas correspondientes. Las cepas aisladas fueron reactivadas, se extrajo y purifico el ADN genómico. Las muestras se secuenciaron mediante tecnologías de última generación y se obtuvo el genoma completo de los aislados. Se analizó la asociación entre la variante genética de virulencia EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 y la presencia de lesión precancerosa tipo metaplasia intestinal, se estimó la razón de prevalencias mediante un modelo lineal generalizado con enlace log, distribución binomial y varianza robusta; también se tipificó el viruloma y resistoma para los genes relacionados con citotoxinas, genes de adherencia, genes moduladores de respuesta inmune y genes de resistencia antibiótica. Resultados: En la primera investigación fueron incluidos 158 casos con dispepsia e infección por H. pylori, el 36.7% de los aislados presentó el genotipo cagA(+)/vacAs1am1 y el 38.6% de los pacientes presentó hallazgo histopatológico de metaplasia intestinal. Se encontró evidencia significativa que la prevalencia de aislados con genotipo cagA(+)/vacAs1am1 fue 67% mayor en los pacientes con metaplasia intestinal respecto a los pacientes con gastritis crónica no atrófica (RP: 1.67; IC95%: 1.13 a 2.45). Este resultado fue similar en el análisis multivariado luego de ajustar por sexo y edad (RP: 1.81; IC95%: 1.25 a 2.61; p<0.05). También se observó asociación significativa del genotipo de riesgo de la región variable del gen cagA (RP: 1.56; IC95%: 1.02 a 2.41; p<0.05), y de la región media (RPa: 2.22; IC95%: 1.01 a 4.99; p<0.05) y la región intermedia (RPa: 1.94; IC95%: 1.05 a 3.58; p<0.05) del gen vacA, frente al hallazgo histopatológico de metaplasia intestinal. En la segunda investigación se incluyeron 49 casos con síntomas de dispepsia que presentaron infección por H. pylori, el 12.2% de los genomas completos secuenciados correspondió a la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 y el 57.1% de los casos presentó diagnóstico histopatológico de metaplasia intestinal. Se observó que la prevalencia de la variante genética de virulencia fue 77% mayor en pacientes con metaplasia intestinal respecto a los casos con gastritis crónica no atrófica, el hallazgo fue significativo (RPa: 1.77; IC95%: 1.13 a 2.77; p<0.05). Se observó que los genes de adhesinas babB/hopT (RPa: 1.19; IC95%: 0.70 a 2.04), hopZ (RPa: 1.49; IC95%: 0.87 a 2.56) y sabB/hopO (RPa:1.41; IC95%: 0.91 a 2.17) fueron prevalentes entre los casos con metaplasia intestinal, pero la evidencia no fue estadísticamente significativa. También hubo evidencia significativa que la prevalencia de aislados de H. pylori resistentes a macrólidos fue 92% mayor en pacientes con metaplasia intestinal respecto a los casos con gastritis crónica no atrófica (RPa: 192; IC95%: 1.24 a 3.11; p<0.05). Conclusiones: Se logró tipificar por PCR convencional los factores de virulencia de aislados de H. pylori procedentes de pacientes con síntomas de dispepsia, y se encontró evidencia que el genotipo cagA(+)/vacAs1am1 presenta un efecto de riesgo en el desarrollo de metaplasia intestinal entre pacientes con dispepsia que presentan la infección por H. pylori. Las repeticiones del motivo EPIYA-C en la región variable del gen cagA se asocian a lesiones precancerosas en los pacientes peruanos con dispepsia, y los polimorfismo virulentos en el gen vacA muestran un efecto de riesgo en el desarrollo de lesiones graves sobre la mucosa epitelial gástrica, sin embargo estos polimorfismos no mostraron una asociación significativa a excepción de las variantes m1 e i1 del gen. Además, se logró secuenciar y obtener genomas completos de calidad de los aislados de H. pylori mediante técnicas de secuenciación de última generación, fue posible tipificar un mayor número de factores de virulencia y determinar variantes genéticas para la integridad del gen cagA y el gen vacA. Hubo evidencia de que la variante genética EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 se relaciona a la lesión precancerosa, y que la frecuencia de estos aislados fue predominante entre los diagnósticos histopatológicos de metaplasia intestinal. Se logró tipificar el resistoma de los asilados de H. pylori y permitió caracterizar a las cepas circulantes como microorganismos resistentes a fármacos macrólidos y quinolonas. En adición, al considerar limitaciones al explorar la relación genotipo – fenotipo la viabilidad de las cepas aisladas de H. pylori es un factor crucial dado que la bacteria es un microrganismo fastidioso de crecimiento lento que emplea un cultivo microbiológico nutricionalmente exigente, que en muestras provenientes de un biobanco compromete su capacidad de reactivación y/o obtención de densidad suficiente para estudios moleculares, no afectando a las técnicas moleculares convencionales de genotipificación de regiones cortas de genes pero si afectando la calidad de secuencias con mayor cobertura aplicados al estudio del genoma completo del microorganismo. Finalmente, ambos estudios aportan evidencias importantes del riesgo de la presencia de factores moleculares de virulencia presentes en las cepas aisladas de H. pylori circulantes en nuestro medio y su relación con las lesiones severas de tipo metaplasia intestinal sobre la mucosa epitelial gástrica de pacientes peruanos con síntomas de dispepsia, y se sugiere que ambos tópicos continúen estudiándose a fin de disponer información de utilidad terapéutica y reducir los casos de cáncer gástrico en nuestra población.

Introduction: Gastric adenocarcinoma is considered the seventh leading cause of death by malignancy in the Americas region. In Perú, cancerization of stomach tissue is the leading cause of mortality associated with neoplastic lesions. Helicobacter pylori (H. pylori) is a common pathogen in humans and is responsible for a variety of gastrointestinal diseases such as gastritis, gastroduodenal ulcer, mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma and gastric cancer. The prevalence of H. pylori infection in Peru ranges from 45% to 83%, and in the last 15 years it has not changed in the middle/high socioeconomic strata and has increased in those populations with socioeconomic deficit and lack of health services. According to the casuistry of the National Institute of Neoplastic Diseases (INEN), 89.6% of cases with gastric adenocarcinoma are infected by the pathogen H. pylori. The interaction of virulence factors present in H. pylori promote molecular changes on the gastric epithelial mucosa that translate into lesions at risk of developing cancer, and it is possible that the types of precancerous lesions observed among patients with H. pylori infection in Peru are related to the molecular virulence markers present in the genome of H. pylori strains circulating in our environment, which would allow us to identify patterns of risk of gastric lesions. Pylori infection in Peru are related to molecular markers of virulence present in the genome of H. Pylori strains circulating in our environment, which would allow us to identify patterns of risk of severe gastric lesions among patients with H. pylori infection. Some genes related to virulence factors of H. pylori are associated with increased risk of neoplastic disease, such as the vacuolizing cytotoxin A (vacA) gene that encodes for the secretion of the toxigenic protein VacA, the cytotoxin A-related gene (cagA) that confers a potent proinflammatory and mitogenic activity to H. pylori, the gene associated with ulceration induced by interaction with the epithelium (iceA), and the gene babA2, for adhesion to blood group antigens, which allows the interaction of the pathogen with the epithelium-interaction-induced ulceration-associated gene (iceA) and the blood group antigen-binding gene babA2, which allow the pathogen to interact with the gastric cell surface. However, the reports of cagA gene typing are still insufficient in our environment and the detection of virulence genes related to the iceA and babA2 genes, as well as the typing and subtyping of the vacA gene have not yet been described. Therefore, it is necessary not only to know the variability and distribution of virulent strains of H. pylori in our environment but also to massively explore molecular characteristics based on the virulome and resistome of the complete genomes of H. pylori isolates and their impact on the histopathological findings of gastric epithelial mucosa in infected patients who present precancerous lesions such as intestinal metaplasia. Research questions: 1) Is the precancerous lesion intestinal metaplasia on the gastric epithelial mucosa associated with the conventional detection of the cagA(+)/vacAs1am1 genotype in Helicobacter pylori strains isolated from Peruvian dyspeptic patients? 2) Is the precancerous lesion intestinal metaplasia on the gastric epithelial mucosa associated with the EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 genetic variant in the whole genome of H. pylori isolates determined by next-generation sequencing technologies from Peruvian dyspeptic patients? Methods: The data analyzed come from a primary study comprising a cohort of 500 patients with dyspepsia and cryopreserved H. pylori isolates in the biobank of the Helicobacter pylori Sentinel Laboratory of the Alexander von Humboldt Institute of Tropical Medicine (IMTAvH), enrolled, and collected between 2016 and 2017 in the Gastroenterology Service of the Cayetano Heredia Hospital. In the first investigation, the design was cross-sectional and used the records of cases with dyspepsia diagnosed for H. pylori infection and their corresponding cryopreserved isolates. Isolates from the sample bank were reactivated and their genomic DNA was extracted. In the samples, H. pylori DNA was amplified by conventional PCR for the detection of virulence factors of the pathogen. The association between disease states according to chronic non-atrophic gastritis and the presence of metaplasia-type precancerous lesions in patients with H. pylori infection against the virulence genotype cagA(+)/vacAs1am1, and using a generalized linear model with log linkage, binomial distribution and robust variance, the prevalence ratio was estimated; the association of the detection of the EPIYA-A, EPIYA-B and EPIYA-C motifs was also analyzed; s1, s2, i1, i2, d1, d2, m1, m2 and subtypes s1a, s1b and s1c of the vacA gene, alleles 1 and 2 of the iceA gene and the babA2 gene against the clinical state of intestinal metaplasia in the cases under study. In the second investigation of an exploratory type, the histopathological report of the cases with H. pylori infection and their corresponding isolated strains were used. The isolated strains were reactivated, and genomic DNA was extracted and purified. The samples were sequenced using state-of-the-art technologies and the complete genome of the isolates was obtained. The association between the virulence genetic variant EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 and the presence of intestinal metaplasia-type precancerous lesion was analyzed, the prevalence ratio was estimated using a generalized linear model with log link, binomial distribution, and robust variance; the virulome and resistome were also typed for genes related to cytotoxins, adhesion genes, immune response modulator genes and antibiotic resistance genes. Results: In the first investigation 158 cases with dyspepsia and H. pylori infection were included, 36.7% of the isolates had the cagA(+)/vacAs1am1 genotype and 38.6% of the patients had histopathological findings of intestinal metaplasia. Significant evidence was found that the prevalence of isolates with cagA(+)/vacAs1am1 genotype was 67% higher in patients with intestinal metaplasia than in patients with chronic non-atrophic gastritis (PR: 1.67; 95%CI: 1.13 to 2.45). This result was similar in the multivariate analysis after adjusting for sex and age (PRa: 1.81; 95%CI: 1.25 to 2.61; p<0.05). Significant association of the risk genotype of the variable region of the cagA gene (PR: 1.56; 95%CI: 1.02 to 2.39; p<0.05), and of the middle region (PRa: 2.22; 95%CI: 1.01 to 4.99; p<0.05) and intermediate region (PRa: 1.94; 95%CI: 1.05 to 3.58; p<0.05) of the vacA gene, against the histopathological finding of intestinal metaplasia was also observed. In the second investigation, 49 cases with dyspepsia symptoms presenting H. pylori infection were included, 12.2% of the complete genomes sequenced corresponded to the EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 genetic variant and 57.1% of the cases presented histopathological diagnosis of intestinal metaplasia. It was observed that the prevalence of the virulence genetic variant was 77% higher in patients with intestinal metaplasia compared to cases with chronic non-atrophic gastritis, the finding was significant (PRa: 1.77; 95%CI: 1.13 to 2.77; p<0.05). The adhesin genes babB/hopT (PRa: 1.19; 95%CI: 0.70 to 2.04), hopZ (PRa: 1.49; 95%CI: 0.87 to 2.56) and sabB/hopO (PRa:1.41; 95%CI: 0.91 to 2.17;) were prevalent among cases with intestinal metaplasia, but the evidence was not statistically significant. There was also significant evidence that the prevalence of macrolide-resistant H. pylori isolates was 92% higher in patients with intestinal metaplasia relative to cases with chronic non-atrophic gastritis (PRa: 1.92; 95%CI: 1.24 to 3.11; p<0.05). Conclusions: We were able to type by conventional PCR the virulence factors of H. pylori isolate from patients with dyspepsia symptoms and found evidence that the cagA(+)/vacAs1am1 genotype presents a risk effect in the development of intestinal metaplasia among patients with dyspepsia presenting with H. pylori infection. The EPIYA-C motif repeats in the variable region of the cagA gene are associated with precancerous lesions in Peruvian patients with dyspepsia, and the virulent polymorphisms in the vacA gene show a risk effect in the development of severe lesions on the gastric epithelial mucosa; however, these polymorphisms did not show a significant association except for the m1 and i1 variants of the gene. In addition, it was possible to sequence and obtain quality complete genomes of H. pylori isolates using next-generation sequencing techniques, to type a greater number of virulence factors and to determine genetic variants for the integrity of the cagA gene and the vacA gene. There was evidence that the EPIYA-ABCC/vacAs1am1i1d1 genetic variant is related to precancerous lesion, and that the frequency of these isolates was predominant among histopathological diagnoses of intestinal metaplasia. The resistome of H. pylori isolates was typed and allowed characterizing the circulating strains as microorganisms resistant to macrolide and quinolone drugs. In addition, considering limitations in exploring the genotype-phenotype relationship, the viability of the isolated strains of H. pylori is a crucial factor given that the bacterium is a fastidious, slow-growing microorganism that uses a nutritionally demanding microbiological culture, which in samples from a biobank compromises its ability to reactivate and/or obtain sufficient density for molecular studies, not affecting conventional molecular techniques for genotyping short regions of genes but affecting the quality of sequences with greater coverage applied to the study of the complete genome of the microorganism. Finally, both studies provide important evidence of the risk of the presence of molecular virulence factors present in the isolated strains of H. pylori circulating in our environment and their relationship with severe intestinal metaplasia type lesions on the gastric epithelial mucosa of Peruvian patients with symptoms of dyspepsia, and it is suggested that both topics continue to be studied in order to have useful therapeutic information and reduce the cases of gastric cancer in our population.