Selección e identificación de aptámeros de ADN capaces de reconocer péptidos derivados de proteínas de membrana de Leishmania braziliensis

Abstract

La Leishmaniasis Tegumentaria Americana (LTA) es una enfermedad parasitaria endémica de zonas tropicales que afecta a la piel y las mucosas, siendo Perú uno de los países que registra el mayor número de casos en América Latina. El protozoario Leishmania braziliensis es el principal agente etiológico de LTA. La detección es clave en el control de la enfermedad. Se reporta que el número de parásitos de Leishmania presentes en las lesiones es generalmente bajo, lo que reduce significativamente la sensibilidad de las pruebas de diagnóstico directas que consisten en la visualización del agente infeccioso mediante el microscopio. Asimismo, las herramientas de diagnóstico molecular de Leishmaniasis requieren una gran infraestructura, equipos y capacitación avanzada de personal. Por ende, el diagnóstico de laboratorio de Leishmaniasis sigue siendo un reto en las zonas endémicas rurales de mayor prevalencia de la enfermedad debido a que no cuentan con recursos e infraestructura necesarios. Este trabajo de investigación propone la selección e identificación de aptámeros de ADN capaces de reconocer con alta afinidad y de forma específica péptidos de proteínas de membrana de L. braziliensis. Primero, se identificaron péptidos de membrana presentes en estadíos de promastigote y amastigote de Leishmania spp. mediante el análisis de datos reportados en la literatura y herramientas bioinformáticas. Los péptidos diana fueron empleados en la selección in vitro de aptámeros mediante el método SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) usando el kit X-Aptamers. Posteriormente, se identificaron los aptámeros candidatos mediante secuenciación y análisis bioinformático. Finalmente, se realizaron ensayos ELONA (ensayo de oligonucleótidos ligados a enzimas) para determinar la caracterización in vitro de los aptámeros candidatos. Se observó que las cinco secuencias seleccionadas como aptámeros candidatos presentaron afinidad in vitro para sus respectivas dianas (péptido 2 y péptido 3). Mediante la razón entre ensayos con el péptido diana (cognate) y un péptido no-diana (non-cognate), se determinó el mejor candidato por la especificidad y alta afinidad por su péptido diana. Se demostró que el sistema X-Aptamers permite la adecuada selección de aptámeros usando péptidos diana con un gran porcentaje de éxito, ya que todas las secuencias seleccionadas mostraron afinidad por las dianas. Del mismo modo, se concluye que la técnica ELONA permite una caracterización primaria de aptámeros. Estos resultados representan el primer paso hacia el desarrollo de un sistema de captura in vitro que permita el enriquecimiento celular de L. braziliensis en muestras biológicas o su detección mediante biosensores.

American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a parasitic disease endemic to tropical areas that affects the skin and mucous membranes, with Peru being one of the countries with the highest number of cases in Latin America. The protozoan Leishmania braziliensis is the main etiological agent of LTA. Detection is key in disease control. It is reported that the number of Leishmania parasites present in the lesions is generally low, which significantly reduces the sensitivity of direct diagnostic tests that consist of visualizing the infectious agent under the microscope. Likewise, molecular diagnostic tools for Leishmaniasis require a large infrastructure, equipment and advanced training of personnel. Finally, the laboratory diagnosis of Leishmaniasis continues to be a challenge in rural endemic areas with the highest prevalence of the disease because they do not have the necessary resources and infrastructure. This research work proposes the selection and identification of DNA aptamers capable of recognizing with high affinity and specifically peptides of membrane proteins of L. braziliensis. First, membrane peptides present in the promastigote and amastigote stages of Leishmania spp. through the analysis of data reported in the literature and bioinformatic tools. The target peptides were used in the in vitro selection of aptamers by the SELEX method (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) using the X-Aptamers kit. Subsequently, suitable candidates were identified by sequencing and bioinformatic analysis. Finally, ELONA (enzyme-linked oligonucleotide assay) assays were performed to determine the in vitro characterization of the candidate aptamers. The fact that the five sequences selected as candidate aptamers showed in vitro affinity for their respective targets (peptide 2 and peptide 3) were ruled out. By means of the ratio between assays with the target peptide (cognate) and a non-target peptide (non-cognate), the best candidate for specificity and high affinity for its target peptide is bloomed. It is broken that the X-Aptamers system allows the adequate selection of aptamers using target peptides with a high percentage of success, since all the selected sequences showed affinity for the targets. Similarly, it is concluded that the ELONA technique allows a primary characterization of aptamers. These results represent the first step towards the development of an in vitro capture system that allows the cellular enrichment of L. braziliensis in biological samples or its detection by biosensors.