Construcción de vectores plasmídicos para la supresión de la expresión de los genes Lrrc8a y Lrrc8b en la línea celular C2C12 de Mus musculus

Abstract

El objetivo del presente trabajo de investigación fue construir vectores plasmídicos para la supresión en la expresión de los genes Lrrc8a y Lrrc8b en la línea celular C2C12 de Mus musculus. Los genes mencionados codifican para proteínas que forman parte de un canal de aniones regulado por volumen (VRAC), el cual se postula como una pieza importante en la secreción de cloruro mediada por AMPc en las células acinares de las glándulas salivales. La técnica empleada para disminuir los niveles de expresión del RNA mensajero (mRNA) de los genes en mención fue small hairpin RNA (shRNA), para lo cual se ocuparon diversas herramientas informáticas las cuales permitieron construir una serie de dúplex, tres por cada gen, que poseen una cadena complementaria a secuencias específicas del mRNA de los genes Lrrc8a y Lrrc8b de Mus musculus. Los dúplex de shRNA fueron ligados correctamente en el plásmido PMKO.1 GFP y transfectados en la línea celular C2C12 de Mus musculus. Finalmente, se transfectaron con éxito tres vectores plasmídicos renombrados como: shRNA Lrrc8a FR1 GFP2, shRNA Lrrc8b FR1 GFP2 y shRNA Lrrc8b FR2 GFP2. Mediante qPCR se midió la eficiencia en el silenciamiento de los genes en cuestión, logrando como resultado una disminución máxima hasta el 40% y 20% en los niveles de expresión del mRNA de los genes Lrrc8a y Lrrc8b respectivamente