Evaluaci?n del cultivo in vitro de Oocitos Bovinos (Bos Taurus l.) utilizando la t?cnica Hanging Drop sobre el desarrollo embrionario

Abstract

El objetivo de esta investigaci?n fue evaluar el cultivo in vitro de ovocitos bovinos (Bos taurus L.) mediante la t?cnica Hanging Drop sobre el desarrollo embrionario. Se utilizaron ovarios de vacas Holstein, obtenidos de un matadero y transportados dentro de las 4 horas posteriores al sacrificio. El complejo de c?mulos de ovocitos se obtuvo por aspiraci?n de peque?os fol?culos antrales (2-8 mm) con aguja de calibre 18. Despu?s de 15 minutos, se desech? el sobrenadante y se diluy? el sedimento en TCM199 con piruvato de sodio 0,2 mM, NaHCO3 4,2 mM, HEPES 2,64 g / l, gentamicina 50 mg / ml para la selecci?n. Se seleccionaron ovocitos con c?lulas de c?mulos compactos multicapa y citoplasma granulado uniformemente. Los AOC se dividieron en dos grupos: para el grupo 1, se colocaron 10 AOC por 40 ul de gotas de medio en placas de Petri y se cubrieron con aceite mineral. El grupo 2 utiliz? la t?cnica Hanging Drop, que consisti? en colocar 10 AOC en gotas suspendidas de medio de 40 ul en placa petri. Para ambos grupos, se utiliz? TCM199 con 20 mg / ml de FSH, 1 mg / ml de 17b-estradiol, FBS al 10%, 50 mg / ml de gentamicina, 2,2 mg / ml de piruvato s?dico, 0,22 g / l de NaHCO3, incubados a 38,5 ? C, 5% CO2, 99% de humedad durante 24 horas. Se utilizaron pajitas de semen congelado de un toro certificado. El medio de fertilizaci?n fue HTF? con 0,01 mg / ml de heparina s?dica, cafe?na 20 mM, 6 mg / ml de BSA. El esperma descongelado se lav? con medio de fertilizaci?n a 500 g durante 5 minutos. La concentraci?n final se ajust? a 1 x 106 espermatozoides / ml. Se utilizaron al?cuotas de 15 ul de suspensi?n de esperma por pocillo, incubando a 38,5 ? C, 5% de CO2, 99% de humedad durante 18 horas. Despu?s de 18 horas, los ovocitos se lavaron con HTF-HEPES? y los c?mulos restantes y los espermatozoides se eliminaron mediante pipeteo mec?nico hasta que los ovocitos se desnudaron. Los presuntos cigotos se colocaron en G-TL? y las placas de cultivo se colocaron en bolsas herm?ticas y se mantuvieron en la mezcla: 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 a 38.5 ? C y 99% de humedad por 7 d?as. La tasa de divisi?n del grupo 2 fue de 65.56%, mientras que para el grupo 1 fue de 60.18%. Se obtuvo un porcentaje promedio de m?rulas y blastocistos del 59.43% y 41.93% para el grupo 2 frente al 56.67% y 36.58% del grupo 1. Hubo diferencia en la tasa de divisi?n, en la obtenci?n de m?rulas y blastocistos con grupo 2 con respecto al grupo 1. Sin embargo, no existe una diferencia significativa en los patrones de desarrollo embrionario con el tratamiento Hanging Drop incluso cuando hay una diferencia porcentual (p <0.05).