?Evaluaci?n de la compatibilidad de tinciones no fluorescentes de Diffquik, Giemsa, Fastblast y de Feulgen con el Bioensayo Cometa en el ADN esperm?tico humano.?

Abstract

La fertilidad masculina puede ser medida mediante un espermatograma convencional, sin embargo este examen no incluye la valoraci?n de la integridad del ADN esperm?tico. Esta variable ha sido correlacionada con las tasas de fertilizaci?n, viabilidad y desarrollo del embri?n, convirti?ndose en una herramienta de importancia cl?nica tanto para los programas de reproducci?n animal como los tratamientos de fertilidad asistida. El bioensayo Cometa es capaz de determinar de una manera exacta el valor de la integridad del ADN esperm?tico, lamentablemente este examen no es de uso rutinario por su elevado costo de implementaci?n ya que utiliza microscopia especializada y tinciones fluorescentes para evidenciar la migraci?n del ADN. El objetivo de esta investigaci?n fue evaluar la compatibilidad de las tinciones no fluorescentes Diffquik, Giemsa, de Feulgen y FastBlast en el bioensayo Cometa usando un m?todo visual y automatizado. Se utilizaron 15 eyaculados previamente seleccionados de acuerdo al manual OMS 2010, para luego ser capacitados en b?squeda de homogeneidad adecuada para la experimentaci?n. Cada muestra fue expuesta a una gradiente de Per?xido de hidrogeno (0, 10, 30,60 y 100 mM) por 1 hora a 4?C para luego evaluar el coeficiente de da?o mediante el m?todo visual y porcentaje de ADN en la cola mediante el m?todo automatizado. Las pendientes de la regresi?n lineal en el m?todo visual indican que los valores obtenidos por la tinci?n control SybrGreen (m=3,69) difieren con Giemsa (m=3,45) y Diffquik (m=2,57). En el m?todo automatizado de igual manera SybrGreen (m=0.83), Giemsa (m=0,79) y Diffquik (m=0,77). Sin embargo SybrGreen es 1,06 veces m?s efectivo que Giemsa en el visual y 1,05 veces en el automatizado, sugiriendo una compatibilidad con el bioensayo cometa. De igual manera SybrGreen es 1,07 veces m?s efectivo que Diffquik en el visual y 1,44 veces en el automatizado, concluyendo una compatibilidad solo en el m?todo visual.Male fertility can be measured by a conventional semen analysis, however, this examination does not include the assessment of sperm DNA integrity. This variable has been correlated with fertilization rates, embryo viability and development, becoming a tool of clinical importance for both animal breeding programs and assisted fertility treatments. Comet bioassay is able to determine an exact way the value of sperm DNA integrity, unfortunately this test is not routinely used because of its high cost of implementation because it uses specialized microscopy and fluorescent dyes to demonstrate DNA migration. The objective of this research was to evaluate the compatibility of non-fluorescent dyes Diffquik, Giemsa, Feulgen and Comet FastBlast in the bioassay using a visual and automated method. 15 ejaculates were used previously manually selected according to WHO 2010 and then be trained in finding adequate homogeneity for experimentation. Each sample was exposed to a hydrogen peroxide gradient (0, 10, 30,60 and 100 mM) for 1 hour at 4 ? C and then assess the damage coefficient by visual method and percentage of DNA in the tail by automated method. The slopes of the linear regressions on the visual method indicate that the values obtained by the SybrGreen Control staining (m = 3.69) differ with Giemsa (m = 3.45) and Diffquik (m = 2.57). In the same way automated method SybrGreen (m = 0.83), Giemsa (m = 0.79) and Diffquik (m = 0.77). However SybrGreen is 1.06 times more effective than Giemsa visual and 1.05 times in the automated, suggesting a comet support bioassay. Similarly SybrGreen is 1.07 times more effective than Diffquik visual and 1.44 times in the automated, concluding compatibility only in the visual method.