Expresi?n, purificaci?n y cristalizaci?n de la prote?na rCynD de Bacillus safensis PER-URP-08

Abstract

La enzima cianuro dihidratasa (CynD) es producida por algunas bacterias y es capaz de degradar el cianuro, una sustancia t?xica utilizada en varias industrias. Para biorremediar el cianuro se necesita mantener un pH de 9, lo que hace que la CynD de algunas bacterias pierdan su actividad. Se necesita la estructura tridimensional de la CynD para entender mejor las interacciones entre sus dominios y superficies y mejorar su tolerancia al pH mediante la creaci?n de mutantes. El objetivo de esta investigaci?n es expresar, purificar y cristalizar la rCynD de B. safensis PER-URP-08 (rCynDPER-URP-08). Se evidenci? que diferentes concentraciones de in?culo de pl?smido (67,8; 135,6 y 271,2 ng/ ?L) pueden transformar Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) con una eficiencia de 1,24; 2,3x10-1 y 7,7x10-1 ufc/ng respectivamente (p=0,49), y que se puede inducir rCynDPER-URP-08 con IPTG a 18o, 30 y 37oC (p=0,1). As? mismo, se obtuvo que la pureza de la prote?na es similar al realizar una cromatograf?a con eluci?n isocr?tica o en gradiente (p=1). Con respecto a la actividad enzim?tica, el Km y kcat de rCynDPER-URP-08 se mantiene a pH 9 (p=0.48 y p=0.093 respectivamente), por lo cual, debe ser considerada como candidata para la biorremediaci?n de residuos con cianuro. En cuatro de las condiciones utilizadas se lograron obtener cristales, siendo los m?s grandes los generados con la adici?n de un stock de amino?cidos (60-95 ?m), mientras que los cristales generados con los cationes divalentes tuvieron un tama?o m?s peque?o (27,78-29,09 ?m) (p=0,0032). Dado que estos aditivos tienen la capacidad de formar sales, es necesario que un siguiente estudio analice el patr?n de difracci?n de rayos X para determinar que los cristales son de prote?nas