Diseño y estandarización de un método de diagnóstico molecular para la detección de SARS-CoV-2

Abstract

Estandariza una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RTPCR) y una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa en tiempo real (qRT-PCR) dirigida al gen de la nucleocápside (N) del SARS-CoV-2. Ello utilizando un control positivo sintético (200.000 copias/μL del gen N) y como controles negativos a coronavirus de los géneros α-CoV, β-CoV, γ–CoV y δ-CoV. Para realizar esto, primero se utilizó herramientas bioinformáticas para diseñar los oligonucleótidos y la sonda fluorescente específica (FAM), luego se evaluó los oligonucleótidos diseñados mediante PCR utilizando diferentes temperaturas con el objetivo de obtener la temperatura de alineamiento, seguidamente se estandarizó la PCR en punto final, realizando diluciones del control positivo del gen N sintético. Posteriormente, se sometió a una qRT-PCR, utilizando diluciones en serie en base 10 del control positivo por triplicado para calcular la curva estándar de la prueba. Al mismo tiempo, se ejecutó un kit comercial 2019-nCoV RUO de la CDC para comparar nuestros resultados. Finalmente, nuestra prueba fue evaluada usando muestras positivas a SARS-CoV-2 de heces de perros y gatos confirmadas por secuenciación. Los resultados de ambas pruebas diseñadas fueron satisfactorios, la RT-PCR amplificó el control positivo, muestras positivas y hubo ausencia de amplificación en los controles negativos. Por otro lado, la qRT-PCR presenta una eficiencia del 92.1%, con una detección mínima de 20 copias del gen por muestra, valores similares al kit comercial de la CDC que muestra una eficiencia del 98% y 89% para el gen N1 Y N2 respectivamente, con una detección mínima de 20 copias por muestra; de tal manera que el kit desarrollado en el presente trabajo y el kit comercial de qRT-PCR presentan resultados similares.