Estandarización e implementación de una técnica de qPCR para la detección de Leptospira sp. patógenas en muestras de orina de caninos domésticos

Abstract

La leptospirosis es una enfermedad zoonótica de importancia mundial en salud pública. La enfermedad en humanos está asociada a la presencia de la bacteria Leptospira spp. en los animales, en las zonas urbanas los animales domésticos como el perro juegan un rol importante en la transmisión de la enfermedad. Los caninos domésticos pueden desarrollar la enfermedad o ser portadores asintomáticos que eliminan la bacteria en grandes cantidades en la orina. El presente estudio tuvo como objetivo estandarizar e implementar una técnica de PCR en tiempo real con sondas TaqMan para detectar la presencia de leptospiras patógenas en muestras de orina de caninos domésticos infectadas experimentalmente con cepas patrón de Leptospira spp. Las muestras de orina fueron obtenidas de un perro clínicamente sano y negativo a la prueba de microaglutinación (MAT). Se utilizaron los cebadores Lepto R y Lepto F, específicos para Leptospira spp., y una sonda TaqMan Lepto probe, que amplifican e hibridan respectivamente una porción del gen rrs, capaces de diferenciar entre especies patógenas y no patógenas de leptospira. Se estandarizó el protocolo de PCR en 35 ciclos, con un proceso de desnaturalización inicial a 95°C por 5 minutos, seguida por una desnaturalización a 95°C por 15 segundos y finalmente el alineamiento y extensión en un solo paso a 60°C por 1 minuto. Los valores de Ct determinados durante la estandarización de la PCR, estuvieron en un rango de 12.53 a 18.21 para las 25 cepas patógenas de Leptospira spp., las cepas saprófitas y otros géneros bacterianos no dieron productos específicos. El estándar fue detectado hasta una dilución de 10² con un Ct de 29.98 a una eficiencia de 1.13 y con un coeficiente de correlación (R²) de 0.993. Se detectó ADN en las muestras de orina infectada desde la dilución de 10⁷ leptospiras/ml con un valor de Ct de 17.54 hasta una mínima dilución de 10² leptospiras/ml con un valor de Ct de 29.87.

Palabras claves: caninos domésticos, PCR en tiempo real, sondas TaqMan, Leptospira spp., Leptospirosis, orina

Leptospirosis is a zoonotic disease of global importance in public health. The disease in humans is associated with the presence of the bacteria Leptospira spp. in animals; in urban areas domestic animals such as dogs play an important role in the transmission of the disease. Domestic canines infected with the bacteria can develop the disease or be asymptomatic carriers, eliminating bacteria in large quantities in their urine. This study aimed to standardize and implement a TaqMan Real-Time PCR assay to detect the presence of pathogenic leptospires in urine samples of domestic canines experimentally infected with standard strains of Leptospira spp. Urine samples were obtained from a clinically healthy dog, negative to the Microagglutination Test (MAT). The primers Lepto R and Lepto F specific for Leptospira spp. and a Lepto TaqMan probe were used, which amplified and hybridized respectively a portion of the rrs gene, differentiating between pathogenic and nonpathogenic species of Leptospira. Thermocycling program was standardized with 35 cycles of 95° C for 15 seconds and 60° C for 1 minute with an initial cycle of 95° C for 5 minutes. Ct values determined during the standardization of PCR were from 12.53 to 18.21 for the 25 pathogenic strains of Leptospira spp. In contrast saprophytic leptospira and other species of bacteria did not produce any specific Ct value. The standard strain was detected up to a dilution of 10² with a Ct value of 29.98 at an efficiency of 1.13 and a correlation coefficient (R²) of 0.993. DNA was detected in infected urine samples from the dilution of 10⁷ leptospires/ml with a Ct value of 17.54 to a minimum dilution of 10² leptospires/ml with a Ct value of 29.87.

Keywords: domestic canines, real time PCR, TaqMan probe, Leptospira spp., Leptospirosis, urine