Selección de aptámeros de ADN con unión al factor IF3 y su caracterización durante la fase de iniciación de la síntesis de proteínas en Escherichia coli

Abstract

En el contexto de resistencia a antibióticos, la síntesis de proteínas es un blanco importante para el desarrollo de nuevos inhibidores. El factor de iniciación 3 (IF3) es esencial en la traducción del ADN bacteriano. El IF3 modula la fidelidad y velocidad de la interacción codón-anticodón del ARNm y el ARNt iniciador durante la formación del complejo de iniciación 30S (30S IC). El IF3 tiene dos dominios el C-terminal, funcionalmente caracterizado, y el dominio N-terminal (IF3N), cuya función aún se encuentra en investigación. Una estrategia innovadora en el campo de la inhibición bacteriana son los aptámeros, secuencias específicas de nucleótidos y altamente afines a una molécula blanco. La presente tesis, por medio de un diseño observacional descriptivo, evaluó la selección de aptámeros de ADN con unión al factor IF3 y su caracterización durante la fase de iniciación de la síntesis de proteínas en Escherichia coli, mediante la metodología combinatoria de evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX) y métodos biofísicos. Se identificaron cuatro potenciales aptámeros para IF3 y cinco para IF3N de Escherichia coli. Se utilizaron las técnicas de pull-down y termoforesis a microescala para identificar al aptámero candidato 343 (Apt343) como específico de unión al IF3N (Kd = 205 ± 164 nM). Los ensayos de cinética rápida acoplada a la transferencia de energía de resonancia intramolecular de Förster (FRET) mostraron que el Apt343 reduce 13 veces la velocidad de unión de IF3 a la subunidad 30S. Además, el aptámero cambia la conformación del IF3 con la llegada de los factores de iniciación IF1 e IF2. Además, se sugiere que Apt343 retrasa el reconocimiento codón-anticodón en la formación de 30S IC. Sin embargo, este retraso no afecta la reacción de unión de la subunidad 50S tras la formación de 70S IC. Se concluye que el bloqueo del IF3N de parte del Apt343 retrasa la formación de complejos intermedios de la fase de iniciación, pero no promueve la inhibición de este proceso. La identificación de aptámeros es una propuesta novedosa para identificar nuevos potenciales antibióticos inhibidores de la síntesis de proteínas que debe ser estudiada desde diferentes perspectivas.