Estandarización de la técnica RT-PCR a tiempo real para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en la trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)

Abstract

El presente trabajo tuvo como objetivo estandarizar y validar la técnica de RT-PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV) en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) en el Perú. Se utilizaron muestras de riñón y bazo de truchas arcoíris provenientes de dos piscigranjas del departamento de Junín, tomándose 61 animales con signos clínicos de enfermedad y 60 animales aparentemente sanos. Todas las muestras fueron evaluadas mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) para determinar la presencia del virus. La prueba de RT-PCR tiempo real se realizó utilizando un kit comercial en dos pasos y utilizando el fluoróforo Sybr Green I. Se utilizaron los primers WB1 y WB2 para identificar un segmento genómico específico de la proteína estructural VP2. Como controles positivos se utilizaron virus inactivado IPNV cepa Sp, así como 10 muestras inoculadas con IPNV; y como controles negativos, se utilizaron virus relacionados a IPNV como son Rotavirus A y el virus de la Bursitis Infecciosa del pollo; así como virus no relacionados. A su vez, se llevó a cabo la inoculación viral en muestras de tejido en diluciones decrecientes para determinar el grado de sensibilidad. Los resultados fueron determinados a partir de los valores del Ciclo Umbral (Ct) y temperatura de Melting (Tm) de los productos amplificados. La prueba fue capaz de detectar al virus hasta concentraciones de 102 UFP/ml. Las 121 muestras de campo resultaron negativas a IPNV; los animales enfermos evidenciaron etiologías de tipos bacterianos y no virales. Los resultados obtenidos determinaron una especificidad del 100% y una sensibilidad del 100%; a su vez, los valores predictivo positivo y predictivo negativo resultaron en 100%. La técnica de RT-PCR en tiempo real estandarizada en el laboratorio representa una técnica valiosa para el diagnóstico de IPNV. Palabras Clave: Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, IPNV, RT-PCR, RT-PCR tiempo real

--- This study aimed to standardize and validate the real-time RT-PCR technique for diagnosis of Infectious Pancreatic Necrosis Virus (IPNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in Peru. Kidney and spleen samples of rainbow trout (n=121) from two fish farms of Junin were taken, 61 animals showed signs of disease and 60 were apparently healthy animals. All samples were assessed by indirect immunofluorescence technique (IIF) to determine presence of virus. Real-time RT-PCR was carried out using a two-step commercial kit. We used WB1 and WB2 primers for amplification of a specific genomic segment of the VP2 structural protein. IPNV Sp strain and 10 samples inoculated with IPNV were used as positive controls; whereas related viruses, such as rotavirus and infectious bursal disease virus from chickens, as well as unrelated viruses were all used as negative controls. Also, we inoculated decreasing dilutions of virus into tissue samples to determine the sensitivity degree of the test. Results were assesssed according to the values of the threshold cycle (Ct) and melting temperature (Tm) of the amplified products. The test was able to detect the virus in concentrations up to 102 PFU/ml. All 121 field samples were negative for IPNV; sick animals were apparently infected by bacterial agents. Real Time RT-PCR’s specificity and sensitivity were around 100%; moreover, the positive predictive value and negative predictive value was also set in 100%. Real time RT- PCR technique standardized in our laboratory is a valuable diagnostic tool for IPNV detection in field samples. Key Words: Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV, RT-PCR, real time RT-PCR