Caracterización biológica y acción de inhibidores de una fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta

Abstract

El envenenamiento por la serpiente Lachesis muta presenta una fisiopatología compleja debido a la presencia de un numeroso grupo de enzimas como la fosfolipasa A2 (FLA2). Por ello, en el presente estudio se ha investigado algunas propiedades bioquímicas de la FLA2 y sus efectos biológicos in vitro e in vivo. Inicialmente la enzima fue purificada mediante dos pasos cromatográficos un CM-Sephadex C-50 seguido por un Sephadex G-50, obteniéndose un factor de purificación de 55.3 veces con un rendimiento de 34.1% y se obtuvo una única banda proteica de 18749 Da, empleando la técnica de PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrándose que la FLA2 es una proteína monomérica. La enzima es termoestable manteniendo su actividad total a 100°C por 10 minutos, es además una enzima dependiente del ion calcio y es fuertemente inhibida por glutation, cisteína, EDTA y PMSF reduciendo su actividad hasta más del 50%. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo que la Dosis hemolítica media (DH50) es 4.35µg y de 67.6µg para la enzima pura y el veneno respectivamente por lo que FLA2 es 15.5 veces más hemolítica que el veneno total. Así mismo se ha demostrado que la dosis miotóxica mínima (DMM) fue muy baja con un valor de 125, 89 μg/ml mientras que para el veneno crudo fue de 144,21 μg/ml. Además, la dosis edemática mínima (DEM) de la enzima fue 91.5 μg. Por otra parte la enzima no mostró actividad hemorrágica usando hasta 30 μg pero en cambio, si mostró tener acción anticoagulante retardando el tiempo de coagulación del plasma citratado a medida que se incremento la concentración de FLA2. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforésis revelaron que FLA2 tuvo reactividad inmunogénica contra el antiveneno lachésico monovalente (INS-Perú), así como una neutralización parcial de la actividad enzimática y hemolítica por acción de dicho suero antiofídico.

The Lachesis muta’s envenomations induce a complex physiopathology due to the presence of numerous enzymes group such as Phospholipase A2 (PLA2). For this reason, in the present study have been investigated some biochemistries’ properties of PLA2 and its in vitro and in vivo biologics effect. Initially, the enzyme was purified in two chromatographics steps, CM-Sephadex C-50 followed by Sephadex G-50, obtaining a purification factor of 55.3 times and with a yield of 34.1% and a unique protein band of 18749 Da was obtained by SDS-PAGE analysis under reducing and non-reducing conditions, indicating that PLA2 is a monomeric protein. The protein is thermostable maintaining its total activity until 100ºC per 10 minutes, so, it is a Calcium ion depending protein and the activity was strongly inhibited by glutation, cistein, ESTA and PMSF which reduce until more 50% of PLA2 activity. As far as its biologic activity was obtain that Media Hemolytic Doses (DH50) was 4.35µg and 67.6µg to pure enzyme and crude venom respectively, this indicate that PLA2 is 15,5 times more hemolytic than crude venom. Likewise, had demonstrated that Minimum Miotoxic Doses (MMD) is very low to PLA2 (125. 89 μg/ml) while to crude venom was 144,21 μg/ml. The enzyme’s Minimum Edematic Doses (MED) was 91.5 μg. For another hand, the PLA2 didn´t show any hemorrhagic activity until 30 μg but it showed has anticoagulant activity on citrated plasma when the PLA2 concentration was increasing. Additionally, the inmunodiffusion and inmunoelectrophoresis probes showed PLA2 had inmunogenic reactivity against anti lachesic nonovalent serum (INS-Perú), as well as a partial enzymatic activity and hemolytic neutralization.