Caracterización estructural, biológica y molecular de una isoenzima básica de Fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente peruana Lachesis muta (Linnaeus, 1766)

Abstract

En la presente investigación se estudian las propiedades, bioquímicas, biológicas, inmunológicas y moleculares de una isoforma básica de Fosfolipasa A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta(PLA2básicaL.muta). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración y de alta performance; la enzima fue purificada 41,2 veces con un rendimiento de 64%. Se obtuvo una única banda proteica de 14,7 kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrando ser una proteína monomérica. Su pH óptimo es de 7,8 y es fuertemente inhibida por el PMSF, EDTA y glutatión. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo la dosis hemolítica media (DH50) en 4,35µg, la dosis miotóxica mínima (DMM) en 18,96µg/ml y la dosis edemática mínima (DEM) 23,56μg. La enzima no mostró actividad hemorrágica ni acción anticoagulante. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2básicaL.muta es reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilachésico (INSPerú). Empleando la metodología de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa del cDNA de PLA2básicaL.muta, con 445 pb; análisis bioinformáticos indican que la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleótidos que codifica un péptido señal de 16 aminoácidos y una proteína madura de 122 residuos, el peso molecular fue de 13,86 kDa y un pI de 8,316. La secuencia aminoacídica, contiene residuos conservados para el sitio catalítico, His48, Asp49, Tyr52 así como para unión al Ca+2, Tyr18, Gly30 y Gly32. El modelaje tridimensional de la PLA2, muestra que está formada por tres hélices-, una lámina- y un lazo de unión al Ca+2. PLA2básicaL.muta mostró alta homología estructural con otras sPLA2 de venenos de serpientes. Finalmente, los estudios revelan que la PLA2básicaL.muta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] básicas de bajo peso molecular. Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y función de una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana. Palabras claves: Fosfolipasa A2, Isoenzima, Lachesis muta, sitio farmacológico, transcrito.

--- In the present research the biochemical, biological, immunological, as well as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicL.muta), were studied. This enzyme was purified using ion exchange, filtration and high performance chromatographical steps, respectively. The enzyme was purified 41,2 times with a yield of 64%. SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 14,7 kDa under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single polypeptide chain. Furthermore, the enzyme had a optimal pH of 7,8 and was inhibited by PMSF, EDTA and glutation. In relation to its biologic activity, a Medium Hemolytic Doses (DH50) of 4,35µg/tube, Minimum Miotoxic Doses (MMD) of 18,96µg/ml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 91,5μg were obtained. For another hand, the PLA2 didn´t show either hemorrhagic or anticoagulant activities, and was recognized and partially inhibited by monovalent antilachesic serum (INS-Perú) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Using RT-PCR methodology and bioinformátics analysis the complete cDNA sequence of PLA2basicL.muta with 445 bp and an open reading frames of 414 nucleotides, were obtained, which encodes a peptide signal of 16 amino acids and a matured protein of 122 residues with 13, 86 kDa and a pI value of 8,3, calculated by in silico analysis. The amino acidic sequence contains conserved residues of His48, Asp49, Tyr52 in the catalytic site, as well as Tyr18, Gly30 y Gly32 in the Ca+2 -binding site. Three-dimensional model of PLA2basicL.muta showed that was conformed by three α-helix, one β-sheet and one Ca+2 -binding ribbon. PLA2basicL.muta shows a high structural homology with other snake venom phospholipases. Finally, studies reveal that PLA2basicL.muta belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49]. This work is the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom enzyme. Key words: Phospholipase A2, Isoenzyme, Lachesis muta, pharmacologic site, transcript.