Expresión recombinante en Pichia pastoris del homólogo de PLA2 miotóxico BaMtx y la serinoproteinasa procoagulante barnetobina

Abstract

Analiza la obtención de la versión recombinante de ambas toxinas en la levadura Pichia pastoris por las ventajas que ofrece como las modificaciones postraduccionales y la formación de enlaces puentes disulfuro. El estudio inicia con la obtención del ARN (25 ± 55 ng/100 µ L)b la síntesis de ADN (1.6 a 4.8 ng ADN/ng ARN) y la posterior amplificación por PCR (reacción en cadena de polimerasa). Los amplicones fueron clonados en el vector pCR2.1cTOPO en células de Escherichia coli TOP10. La secuenciación confirma la obtención de Barnetobina y BaMtx junto con dos nuevas secuencias codificantes, BATXPLA3 (otra miotoxina de B. atrox) y BbtcSVSP2 (otra serinoproteinasa de B. barnetti). Se logra la subclonacion de Barnetobina y BaMtx en los vectores de expresión PICZac (que incluye una cola de polichistidina y un gen de resistencia al antibi7tico zeocina) y pPIC9 (con un gen de HIS4 como marcado de seleccion por auxotrof2a) respectivamente.