Uso de dos Análogos de Superóxido Dismutasa para prevenir la Desestabilizaciòn Espermática Prematura durante la Criopreservación y Vitrificación en espermatozoides de Alpaca

Abstract

El presente trabajo consta de 3 experimentos y tuvo como objetivo principal evaluar el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante los procesos de criopreservación y vitrificación de espermatozoides de alpaca sobre parámetros de funcionalidad espermática. En el Experimento 1, 15 muestras espermáticas obtenidas de la cola del epidídimo y 5 muestras de semen de alpaca fueron vitrificadas en medios Tris base y HTF utilizando diferentes azúcares (fructosa, sacarosa y trehalosa) en 3 concentraciones diferentes (0.25, 0.5 y 1.0 M). Se obtuvo menos de 1% de motilidad y menos de 5% de viabilidad utilizando el medio HTF. En el Experimento 2, 6 muestras de espermatozoides frescos de alpaca fueron incubados durante 3 horas a 37 °C en un medio Tris-base junto con polimorfos nucleares (PMN) activados con 100 nM de PMA (Phorbol myristate acetate) para inducir la formación de ROS. Se demostró que la motilidad espermática se reduce significativamente (p< 0.05) en el grupo con polimorfos activados (13.67%) en comparación con el grupo control (22.42%). En el Experimento 3, se evaluó el efecto de 2 antioxidantes análogos de superóxido dismutasa (Tempo y Tempol) durante el proceso de criopreservación en un medio en base a leche descremada y etilenglicol, encontrando que con la adición de Tempo y Tempol se obtiene una mayor (p<0.05) motilidad espermática en comparación al grupo control (19.63% y 22.57% vs. 10.62%), mayores porcentajes (p<0.05) de integridad de membrana (14.31% y 13.08% vs. 10.38%) y se obtiene (p<0.05) mayores porcentajes de espermatozoides con ADN no fragmentado (74.20% y 83.76% vs. 63.68%). La variable espermática de vitalidad/integridad acrosomal no fue afectada significativamente por la adición de los antioxidantes Tempo y Tempol. Se concluye que la incubación de espermatozoides de alpaca incubados con PMN activados con PMA tienen un efecto nocivo en la motilidad espermática, y que durante la criopreservación de semen la pérdida de motilidad espermática, pérdida de integridad funcional de membrana y aumento de la fragmentación de ADN espermático pueden ser prevenidos parcialmente mediante la utilización delos antioxidantes Tempo ó Tempol como parte del dilutor de semen.

-- Palabras clave: Espermatozoides, alpaca, criopreservación, ROS, antioxidante, tempo, tempol.

-- The present study had 3 experiments and the main objective were to evaluate the effect of two superoxide dismutase mimics (Tempo and Tempol) during semen sperm cryopreservation and vitrification on alpaca sperm function. In Experiment 1, vitrification of alpaca sperm was evaluated using extenders based on Tris solution and HTF, with different sugars as cryoprotectants (fructose, sucrose, and trehalose) in different concentrations (0.25, 0.5 y 1.0 M). Only few spermatozoa motile (<1%) and viable (<5%) were found in group HTF.In Experimental 2, six samples of fresh alpaca sperm were incubated during 3 hours at 37 °C on a medium based on Tris with polymorphonuclear activated by 100 mM PMA (phorbol myristate acetate) to induce ROS production. Sperm motility was significantly reduced (p< 0.05) when sperm were incubated on a medium con high levels of ROS (13.67%) in comparison with control group (22.42%). In Experiment 3, two superoxide dismutaseanalogues (antioxidants Tempo and Tempol) were evaluated during cryopreservation process on an extender based on skim milk and ethylene glycol. Addition of Tempo or Tempol result in higher (p< 0.05) sperm motility in comparison than control group (19.63% and 22.57% vs. 10.62%). Functional sperm membrane integrity were also higher (p<0.05) in groups Tempo (14.31%) and Tempol (13.08) than control group (10.38%). In the same way, DNA integrity washigher (p< 0.05) in groups Tempo (74.20%) and Tempol (83.76%) than control group (63.68%). Viability and acrosomal integrity were not affected by cryopreservation with superoxide dismutase analogues. We conclude that alpaca sperm incubation on PMN activated by PMA had a detrimental effect on alpaca sperm motility, and that motility, functional sperm membrane integrity and DNA integrity could be partially protected by administration of Tempo or Tempol as components of extender for cryopreservation alpaca semen.

-- Key words: Sperm, alpaca, cryopreservation, ROS, antioxidant, tempo, tempol