Efecto del proceso de criopreservación sobre las proteínas antioxidantes GPX1 Y GPX4 de espermatozoides epididimarios de alpaca (Vicugna pacos)

Abstract

Actualmente se han desarrollado trabajos sobre la criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca, demostrando disminución en los parámetros de viabilidad, motilidad e integridad de la membrana plasmática luego del proceso de descongelación, debido principalmente a especies de oxígeno reactivas producidas durante el proceso de congelamiento. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la criopreservación sobre las proteínas antioxidantes GPX1 y GPX4 de espermatozoides del epidídimo de alpaca, usamos muestras (n: 30) de espermatozoides provenientes de la cola del epidídimo, se usó un método de congelamiento lento usando dimetilacetamida (0,375 M) como agente crioprotector, analizamos los parámetros de la motilidad, viabilidad e integridad de la membrana plasmática antes y después del proceso de congelamiento; así mismo evaluamos los extractos de proteínas de espermatozoides antes y después del congelamiento para evaluar el estado de estas proteínas mediante Western blott, la evaluación de la localización intracelular de estas proteínas se realizó mediante la técnica de inmunofluorescencia. Se usó la técnica de RT-PCR-RT para evaluar el nivel de expresión del gen GPX4 en biopsias de tejido testicular. Los resultados mostraron una disminución en los porcentajes de los parámetros de viabilidad, motilidad e integridad de la membrana plasmática luego del proceso de congelamiento, la localización intracelular de las proteínas GPx1 (cabeza del espermatozoide) y GPx4 (flagelo del espermatozoide) muestran los principales lugares de acción de estas proteínas, por Western blot obtuvimos bandas de peso molecular variado para GPx1 (formas inactivas de la proteína) y bandas de peso molecular de 27kDa para GPx4 (forma activa); obtuvimos una relación significativa positiva y débil entre el nivel de expresión molecular del gen GPx4 y la motilidad pre y post congelamiento. La ubicación de las proteínas GPx1 y GPx4 demuestra sus funciones de protección del espermatozoide de alpaca, la cual no se vio afectada por el proceso de criopreservación, pero el estado (forma activa) de la proteína GPx1 si se vio afectada. Existe una relación positiva significativa (p<0.01) entre el nivel de expresión relativa del gen GPx4 respecto a la movilidad espermática. Palabras clave: Alpaca, criopreservación, espermatozoides, glutatión peroxidasa

--- Currently works about cryopreservation of epididymal alpaca sperm have been developed, showing decrease of the parameters of viability, motility and plasma membrane integrity after thawing process, mainly due to reactive oxygen species produced during cooling process. The aim of this study was to evaluate the effect of cryopreservation over the antioxidant proteins GPx1 and GPx4 from epididymal alpaca sperm. We used samples (n:30) of sperm obtained from the cauda of epididymis, and a slow freezing process with dimethylacetamide (0.375M) as a cryoprotectant agent. It was analyzed the parameters of motility, viability and integrity of plasma membrane before and after cooling process; the protein extracts from sperm was evaluated before and after cooling to examine the state of this protein by western blott technique; the intracellular localization of this proteins was done by immunofluorescence technique, the expression level of gene Gpx4 in testicular tissue biopsies was quantified by RT-PCR-RT. The results showed a decrease in the percentage of viability, motility and plasma membrane integrity after thawing process; the intracellular localization of GPx1 and GPx4 were identified in regions such as the head (GPx1) and flagellum (GPx4) of sperm, by western blot we got bands of GPx1 inactive forms of the protein and the active form of GPx4 (27 kDa); It was obtained a significant positive relationship between the level of molecular gene expression of GPx4 and motility before and after cooling process The location of proteins GPx1 and GPx4 demonstrate its functions of protection of alpaca sperm, which was not altered by the cryopreservation process, but the state (active form) of protein GPx1 was affected. There is a positive weak correlation between the level of GPx4 gene relative expression with sperm motility. Key words: Alpaca, cryopreservation, spermatozoa, glutation peroxidase.