Estudo dos parâmetros de engenharia de processo que afetam a fisiologia e a produção de inulinase por Kluyveromyces marxianus ATCC16045

Abstract

La producción de inulinasa por Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 fue sensible al esfuerzo de corte. El gen INU1 regula la producción que se dio en dos fases, a nivel basal sub represión catabólica e en grandes cantidades después del consumo total del substrato. La producción en medios complejos es mayor que en medio mínimo y varió en función de la fuente y concentración de carbono, nitrógeno y oxigeno. La masa molar del monómero de inulinasa fue 59 kDa (SDS-Page). La actividad específica intrínseca de la inulinasa fue de 879 UI/mg de inulinasa. La inulinasa representa menos del 0,1 % del carbono y nitrógeno, siendo despreciable en un modelo estequiométrico de producción. La cuantificación metabolitos por HPLC fue optimizada usando diseño experimental. El estrés mecánico se manifiesta bajo inanición y la inulinasa fue producida en condiciones extremas de alimentación y agitación. La mayor producción de 50 UI/mL fue a 0,22 h-1 de velocidad de dilución. Velocidades de dilución mayores que 0,36 h-1 provocan el wash out. El efecto combinado del esfuerzo de corte, consumo de potencia, coeficiente global de transferencia de oxigeno y velocidad de dilución describen las principales variables del proceso y son importantes en escalamiento y proyecto del proceso.

A produção de inulinase por leveduras em batelada simples foi sensível a tensão de cisalhamento. Em virtude disto o estresse mecânico e a transferência de oxigênio no sistema têm que ser considerados durante o estudo de aumento de escala deste processo. Este processo, em Kluyveromyces marxianus ATCC 16045, é produto da expressão regulada do gene INU1, e em batelada simples é feita em duas fases, a primeira em nível basal sob repressão catabólica, e a segunda após o consumo total do substrato onde é produzida em grandes quantidades. A produção em meio complexo é maior ao meio mínimo. A melhor concentração de sacarose para produção da enzima foi 30 e 20 g/L em meio mínimo e complexo, respectivamente. A melhor concentração de sulfato de amônio foi 5g/L quando a concentração de sacarose foi de 10 g/L. O enriquecimento do ar, com oxigênio, não eliminou a produção de etanol nem melhorou a produção da enzima em nenhum dos tipos de meio testados. Através de eletroforese SDS-Page, foi determinado a massa molar do monômero da inulinase sendo esta igual a 59 kDa. A atividade específica intrínseca da inulinase obtida foi de 879 UI/mg de inulinase. A inulinase representa menos de 0,1 % de carbono e nitrogênio, sendo desprezível sua consideração num modelo estequiométrico para descrever sua produção. A determinação de metabólitos por HPLC durante o crescimento da levedura foi otimizado usando planejamento experimental e as melhores condições de separação na coluna HPX-87H foram: 40 °C, 0.7 mL/min e fase móvel de H2SO4 a pH 1. O estresse mecânico se manifesta em situações de inanição e a inulinase foi produzida em condições drásticas tais como taxas de diluição baixas (0,01 h-1) combinadas com altas tensões de cisalhamento (0,6 Pa). A melhor produção da enzima (50 UI/mL) foi atingida a taxas de diluição de 0,22 h-1 usando duas turbinas de disco a 1200 rpm. Taxas de diluição maiores que 0,36 h-1 provocaram o arraste de células do biorreator. Fatores definidos pela combinação de um ou mais dos seguintes parâmetros: tensão de cisalhamento, consumo de potência, coeficiente de transferência de oxigênio e taxa de diluição, permitiram descrever satisfatoriamente as principais variáveis do processo indicando sua importância no projeto do processo.