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Yarlequé Chocas, Armando
Quispe Cerón, Edwin
2021-02-19T18:40:52Z
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2020
Quispe, E. (2020). Caracterización molecular y clonamiento de una fosfolipasa A2 ácida del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y su relación en la miotoxicidad. Tesis para optar el título de Magíster en Biología Molecular. Unidad de Posgrado, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.
https://hdl.handle.net/20.500.12672/16107
Las fosfolipasas A2 (PLA2) del veneno de las serpientes, son enzimas con una variedad de efectos biológicos, los cuales son atribuídos a sus diferentes isoformas ácidas y básicas. Algunas son: anticoagulantes, miotóxicas o neurotóxicas, siendo la miotoxicidad uno de los efectos más graves. Además, el clonamiento y expresión de una proteína recombinante es una herramienta importante para entender la estructura-función de una proteína, por ello, el objetivo de la presente investigación fue purificar, caracterizar y evaluar la actividad miotóxica de una isoforma nativa de PLA2 ácida (denominado BaPer-PLA2a) de B. atrox así como clonar y expresar su forma recombinante. Para ello, se purificó la proteína nativa en tres pasos cromatográficos usando DEAE-Sephadex-A50, Sephadex-G75 y un sistema cromatográfico automatizado líquido de presión media (MPLC). La enzima BaPerPLA2a tuvo una actividad específica de 34.1 U/mg y un peso molecular de ~14.5 kDa por SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Asimismo, se aisló el RNA total para la síntesis de cDNA y se obtuvo una longitud de 372 pb. Se dedujo de la secuencia de cDNA una proteína madura de 124 aminoácidos con un pI teórico de 4.41, evidenciando una isoforma ácida. La estructura primaria de esta proteína presenta regiones conservadas en el centro catalítico His48, Asp99, Tyr73 y Tyr52, en el loop de unión al Ca2+ Tyr28, Gly30, Gly32 y Asp49 y la presencia de siete enlaces disulfuro, perteneciendo por tanto a la clase D49PLA2. El modelo teórico estructural de la isoforma tiene una homología del 76.5 % con la PLA2 ácida de B. jararacussu (PDB: 1U73.1A). Asimismo, la BaPer-PLA2a no presenta actividad miotóxica, no obstante, al combinarla con la isoforma de PLA2 básica incrementó la actividad de esta última en 21.58 %. Adicionalmente, el gen fue insertado en el vector pPicZαA y se usó para la transformación y propagación a Escherichia coli, cepa Top10F´, llegando a obtener un inserto de rPLA2a de ~500 pb lo que indica que el clonamiento fue exitoso. Por otro lado, se usó a Pichia pastoris cepa GS115 en los ensayos de expresión de la proteína recombinante, lo cual no se evidenció debido a la optimización en algunos parámetros.
Perú. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (Fondecyt). Proyecto de investigación básica y aplicada. N° 168-2017-FONDECYT
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. Programa de Proyectos de Investigación para Grupos de Investigación. B18100081
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Universidad Nacional Mayor de San Marcos
info:eu-repo/semantics/openAccess
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/
Repositorio de Tesis - UNMSM
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Enzimas - Análisis
Serpientes venenosas - Venenos
Venenos - Análisis
Fosfolipasa A2
Toxinas - Análisis
Caracterización molecular y clonamiento de una fosfolipasa A2 ácida del veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y su relación en la miotoxicidad
info:eu-repo/semantics/masterThesis
Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de Ciencias Biológicas. Unidad de Posgrado
Biología Molecular
Magíster en Biología Molecular
PE
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01
https://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.03
https://purl.org/pe-repo/renati/level#maestro
07649561
https://orcid.org/0000-0002-8038-2162
10653057
511027
Aguilar Puntriano, César Augusto
Sotil Caycho, Giovanna Elizabeth
Sulca López‬, ‪Marcos Alejandro
https://purl.org/pe-repo/renati/type#tesis
Pública



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