Clonación molecular y caracterización de la Acetil-Coa Carboxilasa (ACCasa) de Ankistrodesmus sp. una enzima clave para la biosíntesis de ácidos grasos

Abstract

Las microalgas, son microorganismos fotosintéticos procariotas y eucariotas, que producen diversos compuestos de interés comercial e industrial, debido al alto contenido de lípidos que poseen, entre los que destacan los ácidos grasos libres, que es de gran importancia para obtener biodiesel. Sin embargo, los estudios moleculares no son claros sobre la biosíntesis de ácidos grasos y la función de los genes involucrados en las vías metabólicas en microalgas. Es por ello, el objetivo del trabajo fue realizar la clonación molecular y caracterización de ACCasa de Ankistrodesmus sp., una enzima clave para la biosíntesis de ácidos grasos. El ARN total se purificó por métodos estandarizados en el laboratorio. Posteriormente se realizó el secuenciado transcriptomico. De la data obtenido, se identificó y se caracterizó una fracción del gen de ACCasa, la subunidad α por análisis bioinformático. La secuencia del gen identificada fue optimizada y expresada en E. coli, y ligada al vector de expresión pET151/D-TOPO, para el transformado de E. coli por electroporación. Finalmente, se purifico el plásmido recombinante y el gen insertado se verificó por PCR. El ARN total, tuvo ratios de calidad entre 1.95 y 2.01, la secuencia del gen αACCasa fue de 1491 pb y 491 aminoácidos. El plásmido recombinante fue de ~7236 pb, y el tamaño del amplicon fue ~119 pb. En conclusión, se purifico el ARN de alta calidad, se clonó y se caracterizó el gen αACCasa de Ankistrodesmus sp.

The microalgae are a very diverse group of prokaryotic and eukaryotic photosynthetic microorganisms, are located in diverse habitats, grow rapidly due to their simple structure, and produce various compounds of commercial and industrial interest. The interest of microalgae is due to the high lipid content they possess, among which the free fatty acids, which are of great importance at the energy level, are the most important, since the biodiesel is obtained from them. However, molecular studies are unclear on the fatty acid biosynthesis and function of the genes involved in metabolic pathway in microalgae. In this sense the objective of this work was to perform the molecular cloning and characterization of ACCase from Ankistrodesmus sp., A key enzyme for fatty acid biosynthesis. Microalgal biomass was obtained from the biotechnology and bioenergetic laboratory of the UCP, with which the total RNA was purified. The transcriptome was then sequenced and a Bioinformatic analysis was identified and characterized by a fragment of the ACCasa alpha-alpha (αACCase) gene. The gene sequence was optimized and expressed in E. coli, and ligated to the pET151/DTOPO expression vector, the primers were also designed and synthesized, the E. coli transformation was performed by electroporation with the expression vector. Finally, the recombinant plasmid was purified and the inserted gene was verified by PCR. Total high quality RNA had quality ratios between 1.95 and 2.01, the sequence of the αACCase gene had 1491 pb and 491 amino acids. The plasmid was ~ 7236 pb. The PCR amplicon was ~ 119 pb. In conclusion, high quality RNA was purified, cloning was performed and the αACCase gene of Ankistrodesmus sp.