Diseño de cebadores específicos de Amplificación Isotérmica Mediada por Horquillas (LAMP) in-house para la detección diferencial del virus dengue

Abstract

En el presente trabajo, se realizó el diseño in-house de cebadores LAMP para el diagnóstico diferencial de los serotipos del virus dengue. Con este fin, secuencias del virus dengue fueron descargadas de la base de datos de GenBank. Las secuencias descargadas fueron alineadas en el software MEGA v7. Posteriormente PrimerExplorer V5 fue utilizado para generar sets de cebadores LAMP candidatos a partir de las regiones más conservadas, por cada serotipo. Cada set de cebadores fue evaluado para la formación de estructuras secundarias y especificidad utilizando OligoAnalyzer v3.1 y Primer Blast, respectivamente. Los sets con funcionamiento experimental específico pasaron a un proceso de optimización de las condiciones de amplificación, empleando colorante rojo neutro como indicador del cambio de pH en un rango de valor de 8U (reacción negativa: amarilla) a 6U (reacción positiva: fucsia). El límite de detección de los sets de cebadores diseñados fue de 664.99 copias/μL para DENV-1, 3035.75 copias/μL para DENV-2, 196476.8 copias/μL para DENV-3, y 207.65 copias/μL para DENV-4. El tiempo de incubación promedio fue de 1 hora ± 10 minutos. La especificidad analítica determinada fue de 100%. Adicionalmente, se evaluó el funcionamiento específico de los cebadores LAMP empleando ARN extraído de siete muestras positivas a DENV-2, más una enzima de transcripción reversa. Los cuatro sets de cebadores diseñados se muestran como una alternativa prometedora para su empleo en las pruebas LAMP.