Implementación y establecimiento de un punto de corte en un test de Wayne cuantitativo para detectar la susceptibilidad a PZA en cultivos MODS de muestras de esputo

Abstract

La pirazinamida (PZA) es una droga importante para el acortamiento del tratamiento antituberculoso, es la única que actúa sobre las micobacterias latentes. La susceptibilidad a PZA puede ser determinada evaluando: el crecimiento de la micobacteria frente a la droga (BACTEC 960), la actividad enzimática de la pirazinamidasa (PZAsa) (Test de Wayne) que detecta al ácido pirazinoico (POA) o molecularmente, identificando variantes o mutaciones presentes en el gen pncA que puede afectar su actividad normal. BACTEC MGIT960 ha sido la única prueba de susceptibilidad (DST) recomendada por la OMS, sin embargo, ha reportado alto índice de falsos resistentes, quizás por la dificultad de mantener un pH adecuado y controlar el inóculo cultivado. El secuenciamiento conlleva un alto costo y, además, un cierto porcentaje de mutaciones puede no afectar la actividad enzimática, o cepas WT manifiestan resistencia, por lo que hay otros mecanismos que estarían implicados en la resistencia. En este estudio planteamos cuantificar la producción de POA en cultivo líquido directamente de esputo luego de su incubación con PZA (MODS-WQ), a diferencia del test de Wayne convencional que se basa en la observación del color. Se usaron 264 muestras de esputo de pacientes con tuberculosis y se evaluó dos variantes del medio: caldo 7H9 y buffer citrato, ambas a pH neutral. La variante en buffer citrato identificó correctamente el 92.6% de los aislados resistentes y el 95.6% de los aislados sensibles, usando como gold estándar las tres DST mencionadas. La variante en 7H9 identificó 81.3% resistentes y 77.2% sensibles. Los resultados se obtuvieron en un promedio de 13 días.

Pyrazinamide (PZA) is an important drug for shortening anti-tuberculosis treatment as it is the only one that acts on latent mycobacteria. Susceptibility to PZA can be determined by evaluating the growth of mycobacteria against the drug (BACTEC 960), the enzymatic activity of pyrazinamidase (PZAsa) through the Wayne Test, which detects pyrazinoic acid (POA) or molecularly, identifying variants or mutations present in the pncA gene that can affect its normal activity. The BACTEC MGIT960 has been the only susceptibility test recommended by the WHO, however, it has reported a high rate of false resistance, perhaps due to the difficulty of maintaining an adequate pH and controlling the amount of cultured inoculum. Sequencing carries a high cost, and, in addition, a certain percentage of mutations may not affect their enzymatic activity, or WT strains show resistance, so there are some mechanisms that are not well studied that would be involved in resistance. In this study we propose to quantify the production of POA in liquid culture directly from sputum after its incubation with PZA (MODS-WQ), unlike the conventional Wayne test that is based on the observation of color. 264 sputum samples from tuberculosis patients were used to evaluate two medium variants: 7H9 broth and citrate buffer, both at neutral pH. The variant in citrate buffer correctly identified 92.6% of the resistant isolates and 95.6% of the sensitive isolates, using the three mentioned DSTs as the gold standard. The 7H9 variant identified 81.3% resistant and 77.2% sensitive. Results were obtained in an average of 13 days.