Generation of a proteomic platform of high processivity for the identification and characterization of recombinant VHHs against CD105

Abstract

Se obtuvieron diecinueve VHHs (dominios variables únicos de los anticuerpos de cadena pesada) que unen a CD105 (endoglina) humano, un co-receptor endotelial de TFG-β implicado en la regulación de la angiogénesis y el desarrollo de tumores, mediante screening por phage display de una biblioteca de ADNc de VHH obtenida de alpacas inmunizadas con un lisado de una línea celular de cáncer de vejiga que sobreexpresa CD105 (T24). Las secuencias de los VHH se analizaron con ExPASY, GeneDoc y BLAST y mostraron las características estructurales típicas de los VHHs. Ellas se clonaron y expresaron en pET22b(+)/E.coli y los VHHs recombinantes se purificaron por cromatografía de afinidad. Trece VHHs anti-CD105 fueron microarreglados en biochips para determinar la especificidad y afinidad a CD105 unido a membrana celular por SPRi, Los datos de SPRi mostraron que los VHHs unen a las células SC, que sobreexpresan CD105, pero no o poco a las células THP-1, que no lo hacen, demostrando especificidad. Los VHHs se agruparon según su especificidad y aproximación de afinidad por SPRi. Los seis VHHs anti-CD105 mejor clasificados, que se unen con alta especificidad y afinidad a CD105 en solución y unido a membrana celular, pueden utilizarse tanto en estudios de la función de CD105 como en nanosondas para el diagnóstico y la terapéutica de enfermedades en que la angiogénesis desempeña un papel importante.

Nineteen VHHs (single variable domain of heavy chain antibodies) that bind to human CD105 (endoglin), an endothelial co-receptor of TFG-β involved in angiogenesis regulation and tumour development were obtained by phage display screening of a VHH cDNA library raised from alpacas immunised with a lysate of a bladder cancer cell line overexpressing CD105 (T24). The VHH sequences were analysed with ExPASY, GeneDoc and BLAST and showed typical VHH structural features. They were cloned and expressed in pET22b(+)/E.coli and the recombinant VHHs were purified by affinity chromatography. Thirteen anti-CD105 VHHs were microarrayed on biochips to determine specificity and affinity to cell membrane-bound CD105 by SPRi, SPRi data showed that VHHs bind SC cells, which overexpress CD105, but not or little THP-1 cells, which do not, proving specificity. VHHs were grouped according to their specificity and affinity approximation for SPRi. The six top- ranked anti-CD105 VHHs, that bind with high specificity and affinity to CD105 in solution and cell membrane-bound, can be used both in studies of CD105 function and as nanoprobes for the diagnosis and therapeutics of diseases in which angiogenesis plays an important role.

Dix-neuf VHHs (domaines variables uniques d'anticorps à chaîne lourde) qui se lient au CD105 humain (endogline), un co-récepteur endothélial pour TFG-β impliqué dans la régulation de l'angiogenèse et du développement tumoral, ont été obtenus par criblage par l'exposition sur phage d'une bibliothèque d'ADNc de VHH provenant d'alpagas immunisés avec un lysat d'une lignée cellulaire de cancer de la vessie surexprimant CD105 (T24). Les séquences VHH ont été analysées avec ExPASY, GeneDoc et BLAST et ont montré des caractéristiques structurelles typiques des VHHs. Elles ont été clonées et exprimées dans pET22b(+)/E.coli et les VHH recombinants ont été purifiés par chromatographie d'affinité. Treize VHHs anti-CD105 ont été analysés sur des biopuces afin de déterminer la spécificité et l'affinité pour le CD105 lié à la membrane cellulaire par SPRi. Les données SPRi ont montré que les VHH se lient aux cellules SC, qui surexpriment CD105, mais se lient faiblement ou pas du tout aux cellules THP-1, qui ne le font pas, ce qui démontre leur spécificité. Les VHH ont été regroupés en fonction de leur spécificité et de l'approximation de leur affinité par SPRi. Les six VHH anti-CD105 les mieux classés, qui se lient avec une spécificité et une affinité élevées au CD105 en solution et lié à la membrane cellulaire, peuvent être utilisés à la fois dans les études de la fonction du CD105 et comme nanosondes pour le diagnostic et la thérapeutique des maladies dans lesquelles l'angiogenèse joue un rôle important.