Evaluación del perfil inmunomodulador del secretoma de células estromales mesenquimales humanas de gelatina de Wharton pretratadas con antígeno soluble de Leishmania braziliensis

Abstract

La Leishmania braziliensis es la principal especie en el Perú que causa Leishmaniasis cutánea y mucocutánea. La gravedad de sus úlceras se relaciona con una reacción inflamatoria exacerbada, por lo que terapias basadas en el secretoma de células estromales mesenquimales (CEM) podrían ser consideradas. El secretoma de las CEM presenta capacidad regenerativa e inmunomoduladora, la cual, incluso, puede ser potenciada cuando se exponen a diversos estímulos o pretratamientos. En este sentido, el objetivo del presente proyecto fue caracterizar el secretoma de las CEM humanas pretratadas con antígeno soluble de L. braziliensis y evaluar su potencial inmunomodulador. Se trabajó con CEMh de gelatina de Wharton las cuales fueron estabilizadas y caracterizadas según los estándares internacionales. En el pase 4 las células fueron pretratadas con antígeno soluble de L. braziliensis (ASL) y LPS como control positivo. Luego del pretratamiento el secretoma obtenido a las 72h fue caracterizado en su expresión de citoquinas, mediante un panel de quimioluminiscencia de 80 blancos, ensayos colorimétricos para medir IDO, IL-6 e iNOS/NO. Además, la capacidad inmunomoduladora fue evaluada en ensayos funcionales con PBMC humanos (n=3), midiendo por citometría de flujo el índice de proliferación linfocitaria y la presencia de poblaciones CD4+ y CD8+, así como subpoblaciones de linfocitos Treg y Th1. Los resultados mostraron un perfil antinflamatorio a nivel de expresión de citoquinas para el pretratamiento con ASL y LPS. Ambos se caracterizaron por una menor expresión de citoquinas proinflamatorias IL-8, TNFα y GRO e incremento de IGFBP-4. Asimismo el LPS produjo un aumento significativo de iNOS y disminución de IL-6, mientras que ASL produjo una disminución significativa de iNOS/NO e IDO. El ensayo funcional no evidenció un efecto antiproliferativo e inmunomodulador significativo para el ASL pero si tendencias a la disminución de las poblaciones proinflamatorias Th1 y CD8+INFγ+ asi como en el aumento de la relación de Treg/Th1. En conclusión el secretoma de las CEMh de gelatina de Wharton pretratadas con ASL presenta diferencias a nivel de expresión de citoquinas con una tendencia a un perfil antinflamatorio, pero sin producir efectos significativos a nivel funcional en cultivos de PBMC de 3 voluntarios.

Leishmania braziliensis is the main species in Peru that causes cutaneous and mucocutaneous Leishmaniasis. The severity of their ulcers is related to an exacerbated inflammatory reaction, so therapies based on mesenchymal stem cell (MSC) could be considered. The MSC secretome has regenerative and immunomodulatory capacity, which can even be increased with the primed or pretreatment. The aim of the present project was to characterize the secretome of human MSC pretreated with soluble L. braziliensis antigen and to evaluate its immunomodulatory potential. We worked with a hMSC population derived from Wharton Jelly which was characterized according to international criteria. At passage 4, cells were pretreated with soluble L. braziliensis antigen and LPS as positive control. After priming the 72h secretome was characterized for its cytokine expression by a chemiluminescence panel of 80 targets and colorimetric assays to measure IDO, IL-6 and iNOS. Furthermore, the immunomodulatory capacity was evaluated in a functional assay with human PBMC (n=3), measuring by flow cytometry the proliferation index and the presence of CD4+ and CD8+ populations, as well as subpopulations of Treg and Th1 lymphocytes. Results showed an anti-inflammatory profile at cytokine expression level for pretreatments with ASL and LPS. Both were characterized by a lower expression of proinflammatory cytokines IL-8, TNFα and GRO and increased IGFBP-4. Likewise, LPS produced a significant increase in iNOS and a decrease in IL-6, while ASL produced a significant decrease in iNOS/NO and IDO. The functional assay did not show a significant antiproliferative and immunomodulatory effect for ASL, but it did show trends towards a decrease in the proinflammatory Th1 and CD8+INFγ+ populations, as well as an increase in the Treg/Th1 ratio. In conclusion, the secretome of Wharton's jelly hMSC pretreated with ASL shows differences in cytokine expression level with a tendency towards an anti-inflammatory profile, but without producing significant effects at the functional level in PBMC cultures from 3 volunteers.