Estudio piloto: evaluación de las variantes de preparación del medio de cultivo 7H9-OADC para el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis usadas en la prueba MODS

Abstract

La tuberculosis es una enfermedad que se encuentra entre las diez principales causas de muerte en todo el mundo según los últimos informes otorgados por la Organización Mundial de la Salud (OMS), motivo por el cual se han implementado diversos métodos de diagnóstico, entre ellos encontramos las pruebas moleculares que presentan ventajas como la automatización, un tiempo corto de respuesta, alta sensibilidad y especificidad; sin embargo, son muy costosas. También se cuenta con pruebas económicas como la baciloscopia que se basa en la observación directa del bacilo de Koch en un microscopio, pero con una sensibilidad muy baja (40% - 70%) o cultivos usando el medio Löwenstein-Jensen u Ogawa, siguen siendo una opción de bajo costo, pero con tiempos de respuesta más prolongados (≥ 24 días). La prueba de Susceptibilidad de Drogas de Observación Microscópica, MODS por las siglas en inglés, que utiliza el medio líquido Middleebrook 7H9 enriquecido con OADC (suplemento compuesto por ácido oleico, albumina, dextrosa y catalasa), casitona y glicerol (7H9-OADC) y el suplemento antimicrobiano PANTA, presenta una alta sensibilidad y especificidad. El MODS se basa en la detección del crecimiento característico de Mycobacterium tuberculosis (MTB), que a su vez evalúa la susceptibilidad a isoniacida y rifampicina en un corto tiempo, es de bajo costo e ideal para su implementación en países en desarrollo. Sin embargo, este método requiere insumos variados y personal altamente entrenado que garantice la correcta preparación del medio de cultivo siendo una limitante de su uso de manera extensiva. En la presente propuesta se evaluaron variantes del medio de cultivo 7H9-OADC (medios alternativos) que solo requieren la adición de agua estéril para usarlos. Los medios alternativos fueron: Medios mezclados, preparados mezclando los componentes del medio en polvo (sin esterilización); y medios liofilizados, preparados mediante liofilización del medio líquido estéril 7H9-OADC. Con el objetivo de tener un medio mínimo que asegure el crecimiento de MTB manteniendo la esterilidad del medio se evaluaron la catalasa (solo en el medio mezclado), el PANTA y la irradiación gamma, generando un total de 10 condiciones (variaciones de los medios mezclados y liofilizados). Los medios con mejores resultados fueron seleccionados y evaluados con muestras de esputo con baciloscopia positiva. El crecimiento bacteriano se determinó por número de microcolonias y porcentaje de crecimiento del aislado de MTB y por porcentaje de crecimiento en las muestras de esputo. El análisis con el aislado de MTB mostró que la adición de catalasa promueve el crecimiento de MTB independientemente del tipo de medio (p=0,006); la radiación gamma no afecta el crecimiento de MTB (p=1) y la presencia del PANTA reduce el crecimiento de MTB de forma significativa en los medios liofilizados irradiados (p<0.05). 26 muestras de esputo fueron positivas en todos los medios con una mediana de días de positividad de 6 ± 3 días con un rango de 4 a 14 días. No se observaron diferencias significativas (p=0,47) en el porcentaje de crecimiento entre el medio 7H9-OADC (100%), medio mezclado (95%) y medio liofilizado (100%). En conclusión, los resultados preliminares muestran que las presentaciones de los medios alternativos tienen un rendimiento similar al medio MODS estándar.

Tuberculosis is a disease that is among the ten leading causes of death worldwide according to the latest reports issued by the World Health Organization (WHO), which is why various diagnostic methods have been implemented, among them are molecular tests that have advantages such as automation, short response time, high sensitivity and specificity; however, they are very expensive. There are also inexpensive tests such as bacilloscopy which is based on direct observation of Koch's bacillus under a microscope, but with a very low sensitivity (40% - 70%) or cultures using Löwenstein-Jensen or Ogawa medium, still a low-cost option, but with longer response times (≥ 24 days). The Microscopic Observation Drug Susceptibility Test (MODS), which uses Middleebrook 7H9 liquid medium enriched with OADC (supplement composed of oleic acid, albumin, dextrose and catalase), casitona and glycerol and the antimicrobial supplement PANTA (7H9-OADC), presents high sensitivity and specificity. MODS is based on the detection of the characteristic growth of Mycobacterium tuberculosis (MTB), which in turn evaluates susceptibility to isoniazid and rifampicin in a short time, is low cost and ideal for implementation in developing countries. However, this method requires a variety of inputs and highly trained personnel to ensure the correct preparation of the culture medium, which is a limitation to its extensive use. In the present proposal, two alternative 7H9-OADC-based media that only require the addition of sterile water for use were evaluated. The alternative media were: Mixed media, prepared by mixing the powdered media components (without sterilization); and lyophilized media, prepared by lyophilization of the sterile liquid 7H9-OADC medium. In order to have a minimum medium that ensures the growth of MTB while maintaining the sterility of the medium, catalase (only in the mixed medium), PANTA and gamma irradiation were evaluated, generating a total of 10 conditions (variations of the mixed and lyophilized media). The best performing media were selected and evaluated with smear-positive sputum samples. Bacterial growth was determined by number of microcolonies and percentage growth of the MTB isolate and by percentage growth in sputum samples. Analysis with MTB isolate showed that the addition of catalase promotes MTB growth regardless of media type (p=0.006); gamma radiation does not affect MTB growth (p=1) and the presence of PANTA reduces MTB growth significantly in irradiated lyophilized media (p<0.05). 26 sputum samples were positive on all media with a median day of positivity of 6 ± 3 days with a range of 4 to 14 days. No significant differences (p=0.47) were observed in the percentage of growth between conventional medium (100%), mixed medium (95%) and lyophilized medium (100%). In conclusion, preliminary results show that the alternative media presentations perform similarly to the standard MODS medium.