Implementación de protocolos de PCR y q-PCR para la detección de herpesvirus en crassostrea gigas y argopecten purpuratus

Abstract

La presente investigación se realizó del 5 de diciembre del 2011 al 20 de marzo del 2012 en el Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ingeniería Pesquera de la Universidad Nacional de Tumbes, y tuvo como objetivo implementar protocolos de PCR Y q-PCR para la detección de herpesvirus en Crassostrea gigas y Argopecten purpuratus. Se recolectaron ejemplares de C. gigas y A. purpuratus de 13 puntos de recolección en las regiones de Piura, Ancash, Lima e Ica. De cada ejemplar se extrajo 100 mg de masa visceral y se realizo la extracción de ADN mediante el protocolo de CTAB. La calidad del ADN extraído fue previamente comprobada mediante la amplificación por PCR del gen de referencia actina con los primers Bi-actin-Fw y Bi-actin-Rev. Los protocolos de PCR se realizaron con los primers C2, C4 y C6 como estándares y los nuevos primer OsHV1Fw1, OsHV1Rev1, OsHV1Rev2 y OsHV1Rev3, se incluyeron un control negativo y un positivo de Ostreid herpesvirus1 proporcionado por el Instituto Francés de Investigación para la explotación del Mar (IFREMER). En el caso de la PCR simple solo se logró la amplificación del control positivo, y no de las muestras. En el caso de la semi nested PCR se logro amplificar 13 muestras de A. purpuratus, las cuales luego de ser secuenciadas se confirmó la presencia de Ostreid herpesvirus1 en 7 muestras, con respecto a la q-PCR se logro amplificar el control positivo probando diluciones de 100,10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 con los primers OsHV1Fw1/OsHV1Rev2. Las secuencias de ADN de las muestras que resultaron positivas mostraron una similitud del 100 % con Ostreid herpesvirus 1 y de 99 a 100 % con Chlamys acute necrobiotic virus un herpesvirus reportado en moluscos. En esta investigación se detectó por primera vez la presencia de herpesvirus en un bivalvo en el Perú y es la primera vez que se reporta para la especie A. purpuratus