Evaluación de la capacidad antiinflamatoria de compuestos tipo nitrona usando un modelo de células RAW 264.7 activadas por lipopolisacárico

Abstract

La inflamación es uno de los procesos biológicos más comunes de nuestro organismo, la cual se presenta en respuesta a la presencia de cuerpos extraños. Hoy en día la terapia antiinflamatoria está compuesta por terapias mixtas, las cuales pueden presentar reacciones adversas, por ello la necesidad e importancia de investigar nuevos compuestos que no presenten estas reacciones, como los compuestos tipo nitrona. La N-oxido-5,5-dimetil-1-pirrolina, fue la primera nitrona a la que se le comprobó propiedades antiinflamatorias, lo que llevo a la realización del presente proyecto el cual tuvo como objetivo evaluar la actividad antiinflamatoria de nuevas nitronas en un modelo de células RAW 264.7. El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad antiinflamatoria inducida por lipopolisacárido de compuestos tipo nitrona en un modelo de células RAW 264.7. El presente estudio se subdividió en tres partes: En primer lugar, se elaboró una curva de calibración de nitrito de sodio, empleando 6 concentraciones distintas (1, 5, 10, 50, 100 y 500 μM) preparadas a partir una solución stock de 10 mM, seguido se colocaron 50 uL/pozo, se incubó la placa por 24 horas a 38 °C, y se realizó la lectura de la placa a 550 nm. Conjuntamente se preparó el LPS a partir de una solución stock de 500 ng/mL, se realizaron diluciones seriadas a concentraciones finales de 0.5, 1, 5, 10, 50 y 100 ng/mL, estas diluciones fueron almacenadas en el refrigerador a 3 °C. En segundo lugar, se realizó el tratamiento de las células, previamente se hizo un cultivo celular en monocapa de células RAW 264.7 en medio completo DMEN. Se obtuvieron 1,4x105 células vivas/mL y se colocaron 100 uL/pozo para llevar a incubación por 24 horas a 38°C. Después de la incubación de las células se observó en el microscopio para comprobar su adhesión en la placa, continuando con la adición de 50 uL/pozo de LPS y la incubación de la misma a 38 °C por 24 horas. Posterior a la incubación se procedió a realizar un ensayo de MTT, con el fin de comprobar el efecto del LPS sobre la viabilidad celular, para poder determinar la concentración más adecuada para su uso. Conjuntamente se realizó el ensayo de MTT con los compuestos tipo nitrona (LQB-106, LBQ-109, LBQ-110, LBQ-124, LBQ-131, LBQ-134, LBQ-141, LBQ-467 y LBQ-476) a una concentración del 5 %, para comprobar el efecto sobre la viabilidad celular. En tercer lugar, se procedió a realizar el ensayo para determinar la cantidad de nitrito formado por las células después de haber sido activadas por LPS, se realizó un cultivo celular en monocapa de células RAW 264.7 incubado por 24 horas a 38°C, después se adicionó el LPS en las concentraciones óptimas, se adicionó los compuestos tipo nitrona procediendo con la incubación por 24 horas a 38°C, para finalizar el ensayo se preparó el reactivo de Griess mezclando por cantidades iguales el reactivo A y B, después de la mezcla se adicionó 50 uL/pozo a la placa, se dejó incubar por 24 horas a 38°C. Después de haber realizado una curva de calibración de nitrito por medio de diluciones seriadas a partir de una solución stock de 10 mM en agua ultrapura se obtuvieron 6 concentraciones diferentes 1, 5, 10, 50, 100 y 500 μM, obteniéndose una buena linealidad (r2:0.998). Se determinó que las concentraciones de LPS más adecuadas para activar las células RAW 264.7 son: 0.5, 1 y 5 ng/mL debido a que presentaron una viabilidad celular por encima del 40%. A su vez se comprobó que los compuestos tipo nitrona al 5% que fueron evaluados (C1 (LQB-106), C2 (LBQ-109), C3 (LBQ-110), C4 (LBQ-124), C5 (LBQ-131), C6 (LBQ-134), C7 (LBQ-141), C8 (LBQ-467) y C9 (LBQ- 476)), no son tóxicos para las células RAW 264.7, ya que todos presentaron una viabilidad celular mayor al 92%. Se observó que las células RAW 264.7 tratadas con los compuestos tipo nitrona producen entre 5.1 y 13.2 μM de nitrito, esta concentración es 95 a 98% inferior al producido por LPS. Finalmente se comprobó que los compuestos tipo nitrona disminuyen considerablemente los niveles de nitrito en las células después de haber sido tratadas con LPS a concentraciones 0.1, 1 y 5 ng/mL, entre 94 y 99% la cual es inferior al producido por LPS a diferentes concentraciones. En este experimento, la formación de una trampa de spin entre los compuestos tipo nitrona y los radicales libres formados por las células activadas podría ser el mecanismo responsable de la capacidad antiinflamatoria de los compuestos estudiados.