Desarrollo de una prueba RT-PCR con Primers específicos – degenerados diseñados para incrementar la sensibilidad de las PCRs de diagnóstico y secuenciación de avibirnavirus

Abstract

La enfermedad infecciosa de la bursa (o enfermedad de Gumboro) afecta a nuestro país causando grandes pérdidas económicas en los planteles avícolas (1). La detección, control y prevención de esta enfermedad es complicada debido a la capacidad infectiva, resistencia y alta variabilidad del virus. Las pruebas existentes para la detección y clasificación del virus han sido útiles para el estudio de la evolución de la enfermedad, no obstante, presentan dificultades con el manejo de los virus de campo en las granjas avícolas. Por dichas razones, en este estudio se evaluó a la técnica de la RT-PCR con primers específicos-degenerados para incrementar la sensibilidad de la PCR como prueba de diagnóstico y la PCR como técnica de secuenciación para IBDV. Las muestras evaluadas fueron una vacuna y bursas infectadas con IBDV. Se evaluaron distintos aspectos en el diseño de la RT-P CR y en la elección del método de extracción. Se realizaron las PCRs de diagnóstico y secuenciación de IBDV para seleccionar el mejor par de primers específicos-degenerados los cuales fueron R6 con F11 para el segmento A y R7 con F12 para el segmento B. Se compararon dos tipos de enzimas transcriptasas inversas (M-MuLV y AMV), obteniendo mejores resultados con la enzima M-MuLV y agregando DMSO al 20%. Además se evaluaron las condiciones finales para la RT-PCR, mediante PCR de secuenciación parcial del segmento A y B, demostrando que el mix de los primers específicos–degenerados junto con hexámeros aleatorios amplifica satisfactoriamente ARN proveniente de tejido de bursas. En conclusión, la RT-PCR diseñada con primers específicos-degenerados en conjunto con los hexámeros aleatorios incrementó la sensibilidad de la PCR de diagnóstico y secuenciación de IBDV. Palabras Clave: Bursa, RT-PCR, IBDV, secuenciación, ARN, DMSO, transcriptasas, M-MuLV, degenerados, hexámeros aleatorios.