Establecimiento in vitro de segmentos nodales de Alternanthera porrigens (Moradilla) y determinación de acido vanilico y acido cafeico mediante cromatografía liquida de alto rendimiento (RP-HPLC)

Abstract

En este trabajo de investigación se evaluaron las condiciones para el establecimiento in vitro y el efecto de reguladores de crecimiento de los segmentos nodales de la especie vegetal nativa de la región Arequipa, Alternanthera porrigens (Moradilla), y se determinó el contenido fenólico (antioxidantes) específicamente ácido vanilico y ácido cafeico presentes en tallo y hojas mediante cromatografía liquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC). Para la etapa de establecimiento in vitro de los segmentos nodales, se seleccionó el medio Murashige & Skoog (MS), se evaluaron tratamientos de desinfección vegetal con etanol 70% y diferentes concentraciones de hipoclorito de sodio (1.0%, 1.5% y 2%) donde la aplicación de etanol 70% con NaClO 2.0 % durante 2 y 7 minutos, respectivamente, presentó mayores porcentajes de viabilidad. Una vez obtenido el método más eficiente de desinfección vegetal, se realizó la etapa de propagación in vitro de segmentos nodales en medio de cultivo sólido MS suplementado con reguladores de crecimiento 6-bencilaminopurina (BAP) y ácido 3- indol-acético (AIA) con el objetivo de evaluar los efectos en la elongación del tallo y generación de brotes (yemas axilares y apicales) bajo condiciones de luz durante 20 días a 20 ± 3°C. Los medios MS se suplementaron con 0 (testigo), 0.1, 0.5 mg/L de AIA y 0, 0.5 y 1 mg/L de BAP donde el tratamiento con concentraciones 0.5 mg/L AIA y 1 mg/L BAP fue la combinación de fitohormonas que presentó resultados óptimos para esta etapa. Posteriormente, se realizó una extracción sólido-líquido utilizando el equipo Soxhlet para la determinación de fenoles totales mediante el método Folin-Ciocalteu en el que se obtuvo un valor de 6.81 mg EAG/g de extracto de moradilla, equiparable a valores reportados en otros trabajos con la misma especie vegetal. Así mismo, se evaluó los compuestos fenólicos ácido vanilico y ácido cafeico presentes en hojas y tallo de Alternanthera porrigens mediante cromatografía liquida de alto rendimiento de fase reversa (RP-HPLC). Se inició por la preparación de los extractos vegetales, donde 1g de peso seco (ps) de la planta (hojas y tallo) fue diluida en metanol: agua: TFA (50:50:0.1) seguido de 30 min de sonicación a temperatura ambiente, luego se centrifugó a 3000 rpm durante 5 min y se filtró con filtros RephiQuik nylon 0.45 μm. 12 Además, se realizó la preparación de los estándares de ácido vanilico y ácido cafeico para obtener la curva de calibración. Los estándares y las muestras vegetales fueron identificados mediante HPLC, empleando una columna RP-18. La separación cromatográfica se corrió a un flujo de 1000 μl.min-1, con un volumen de inyección de 20μL y una fase móvil que consistió en lo siguiente: una mezcla del eluyente A (agua ultrapura más TFA) y eluyente B (Metanol más TFA). La gradiente utilizada fue la siguiente: 0 min, 75% de A y 25% de B; 5 min, 75% de A, 25% de B, 15 min, 55% de A y 45% de B, 30 min, 20% de A y 80% de B, 40 min, 75% de A y 25% de B a una longitud de onda de entre 254 nm. Los ensayos se realizaron por duplicado. Finalmente, con este análisis se logró determinar y cuantificar ácido vanilico y ácido cafeico obteniendo 67.83 ppm AV/g y 26.53 ppm AC/g, respectivamente, de los extractos preparados.