Efecto de la autofagia mediada por chaperona (CMA) en la estabilidad, agregación y actividad de la proteína TDP-43 en células HEK293

Abstract

La autofagia mediada por chaperona (CMA) es una vía catabólica lisosomal selectiva e individual en mamíferos, cuyo fin es mantener la proteostasis celular por medio de la degradación discriminante de toda proteína intracelular soluble poseedora de una secuencia de motivo tipo KFERQ y que esté mal plegada, dañada o formando agregados en el citoplasma; dentro de los substratos de CMA, está TDP-43, proteína nuclear que regula el metabolismo del ARN, predispuesta a perder su conformación estable y a aglomerarse en el citoplasma, debido a que posee un dominio rico en glutamina y asparagina (Q/N) que y puede actuar como región tipo prion. El objetivo de este trabajo de investigación fue estudiar si la estabilidad, agregación y función de la proteína TDP-43 son reguladas por la CMA. Métodos: Se empleó la línea celular HEK293 TDP-43 WT, que sobre-expresa la proteína TDP-43 silvestre gracias a un sistema de encendido por tetraciclina (inducción), para realizar una transfección de los motivos KFERQ editados por mutagénesis, analizándose la cantidad relativa de TDP-43. En segundo lugar, se utilizó el modelo celular HEK293 TDP-12xQ/N, capaz de sobre-expresar y generar agregados de TDP-43 fusionados a repeticiones en tándem de la región Q/N, al cual se le transfectó la proteína LAMP-2A, luego se indujo la producción de TDP-43 exógena hasta por 72 h para identificar la distribución de las proteínas TDP-43 y LAMP-2A. En tercer y último lugar, se emplearon las líneas celulares HEK293 Flp-In (sin sobre-expresión alguna) y HEK293 TDP-43 WT, para generar nuevas líneas celulares que sobre-expresaran la proteína LAMP-2A, tal como se hizo con la línea HEK293 TDP-12xQ/N L2A. Resultados: Se generaron líneas con motivos KFERQ editados: HEK293 TDP-43 QV/AA, HEK293 TDP-43 QD/AA y HEK293 TDP-43 QV/AA + QD/AA. Se observó la menor vida media (6 a 20 h) de TDP-43 en HEK293 TDP-43 QV/AA + QD/AA y la mayor (8 a 174 h) en HEK293 TDP-43 QD/AA. Además, HEK293 TDP-43 QV/AA presentó una vida media similar al control (5 a 25 h), pero, a partir de 24 h post-inducción, manifestó un incremento sostenido. En segundo lugar, HEK293 TDP-12xQ/N, a partir de 48 h, agotó el contenido nuclear de TDP-43 e incrementó la presencia de TDP-43 citoplasmática; mientras que, se generó la línea HEK293 TDP-12xQ/N L2A y, en esta, desde las 12 h, se observó la desaparición de TDP-43 nuclear y la acumulación de TDP- 43 en el citoplasma. Conclusiones: Al bloquear la degradación de TDP-43 a través de la CMA editando los motivos KFERQ, se vio que, respecto al motivo canónico QVKKD, la vida media fue equivalente a la de TDP-43 silvestre; luego, sobre el motivo no descrito QDLKE, la estabilidad proteica fue mayor a la del resto de líneas celulares, mientras que la doble mutante en los motivos QVKKD y QDLKE mostró la mayor reducción en la vida media. En cuanto a la estimulación de la CMA a través de la superproducción de LAMP-2A, empleando el modelo celular HEK293 TDP-12xQ/N L2A, que imita la agregación de TDP-43 y sus secuelas, no se redujo la formación de agregados de TDP-43.