Evaluación del potencial de la secuencia señal del factor VIII para secretar proteínas recombinantes en líneas celulares de mamíferos

Abstract

Esta tesis determino la capacidad de secreción de la secuencia señal del factor VIII de coagulación humana para secretar proteínas heterólogas en las líneas celulares de mamíferos. Inicialmente, se generó por PCR, una variante secretada de la proteína amarilla fluorescente (YFP) a través de la fusión de la secuencia señal del factor VIII a la región codificante de esta proteína, formando así, el vector pLV/spEYFP_IRES_DHFR. En cada uno de los clones 6 generados de este vector, fue confirmado su fidelidad y similaridad a través de secuenciación, de los cuales, el clon CR5 fue seleccionado por presentar la mayor similaridad con la secuencia teórica. Para evaluar la capacidad de secreción, fueron usados los vectores que contenian una variante secretada de la proteína YFP modificado por la secuencia señal de la interleucina-2 y la albumina, caracterizados por su alta capacidad de secreción. Junto al clon CR5, estos vectores fueron usados para generar las poblaciones celulares mixta por transfección transitoria y estable, en las líneas celulares HEK293T y CHODG44, respectivamente. A partir de electroforesis SDS-PAGE y por microscopia de fluorescencia fue posible la detección de la proteína YFP en el medio condicionado. En los ensayos de los niveles de secreción de la proteína YFP por fluorometria en todas las poblaciones celulares generadas, no se encontró ninguna diferencia estadística entre el clon CR5 con los otros vectores evaluados. Demostrando así, que la secuencia señal del factor VIII presenta una capacidad de secreción similar al de esas secuencias señal ampliamente usadas en procesos biotecnológicos.