Desarrollo y validación de un método analítico de cromatografía líquida de ultra alta eficacia acoplada a espectrometría de masas para la determinación de clonazepam en plasma humano

Abstract

Desarrolla y valida una técnica analítica, basada en la metodología de cromatografía liquida de ultra alta eficiencia acoplada a espectrometría de masas en tandem (UPLC-MS/MS), para la determinación de clonazepam en plasma humano. La cuantificación se realizó mediante el método de estándar interno. Las muestras contaminadas con clonazepam se sometieron a un proceso extracción en fase sólida previamente a su análisis. La separación se realizó en una columna con un tamaño de partícula de 1,7μm, mediante elución en gradiente y a 50°C. La detección fue operada en modo de ionización positiva por electrospray, y con monitorización de fragmentos múltiple (MRM), siendo las transiciones establecidas de m/z 316 → 270 para clonazepam y m/z 314 → 268 para el estándar interno. Los tiempos de retención fueron de 1,24 y 1,30 min para el clonazepam y el estándar interno respectivamente. El límite de cuantificación (LLOQ) fue establecido en 2,5ng/mL y el límite de detección (S/N > 3) fue de 0,05 ng/mL. El método resultó ser lineal en el rango de 2,5 a 100 ng/mL (r2= 0,999; curva de calibración y = 0,699x + 0,140). El %CV (Precisión) y la desviación del valor nominal de concentración (% Exactitud) fueron menores de 15% en todos los niveles de concentración. El porcentaje de recuperación y el efecto matriz de la muestra fueron de 81,48% y 0,26% respectivamente. La variación de la concentración en los ensayos de estabilidad fue menor de 15%. De esta manera se demostró que el método es altamente rápido y sensible, habiendo cumplido con las exigencias dadas por la Guía de Validación de Métodos Bioanalíticos de la FDA, siendo el método potencialmente aplicable a estudios de monitorización de niveles plasmáticos, perfil farmacocinético y estudios de bioequivalencia del clonazepam.