Aislamiento y enriquecimiento in vitro de células madre espermatogoniales de alpaca (Vicugna pacos) y caracterización de co-cultivos con células de Sertoli

Abstract

Establece un protocolo de enriquecimiento de las células madre espermatogoniales (SSC) mediante gradientes discontinuas de Percoll y desarrollar co-cultivos con células de Sertoli que permita el cultivo continuo de las SSC, sentando las bases para futuros trabajos que busquen contribuir con la conservación del material genético de especies con problemas de fertilidad. Veinte muestras testiculares de alpacas adultas provenientes del Camal Municipal de Huancavelica fueron seleccionadas según sus parámetros espermáticos. Las biopsias testiculares fueron sometidas a dos digestiones enzimáticas, cuya suspensión resultante fue denominada Grupo Control (GC), y la purificación de éstas mediante las gradientes discontinuas, Grupo Post Percoll (GPP). Las muestras fueron evaluadas mediante Citometría de Flujo (CF) y Microscopía de Fluorescencia (MF) empleando el conjugado DBA-FITC con el que se identificó a las SSC como el grupo celular con mayor intensidad de fluorescencia (sDBA+). La evaluación por CF de 8 muestras y el análisis por MF de las 12 muestras restantes mostraron una mayor media porcentual de la población de SSC en el GPP en comparación a la del GC, afirmando el enriquecimiento de las SSC mediante las gradientes de Percoll (p<0.05). Además, la comparación de la viabilidad celular entre ambos grupos (GC: 92.59 ± 6.92% y GPP: 92.47 ± 5.79%) no mostró diferencia significativa (p>0.05). Estas poblaciones celulares iniciales (GC y GPP) fueron cultivadas durante 8 días en medio DMEM, denominándose Grupo Cultivo Control (GCC) y Grupo Cultivo Post Percoll (GCP) y fueron evaluados por CF y MF, encontrándose un aumento de la población de SSC en los post-cultivos. El análisis por CF no mostró diferencia significativa entre los grupos iniciales y sus respectivos cultivos (GC: 37.02 ± 29.21% vs GCC: 44.80 ± 19.63% y GP: 62.46 ± 33.15% vs GCP: 53.16 ± 14.49%); por el contrario, la evaluación por MF sí mostró un incremento significativo de la población sDBA+ en los cultivos (GC: 13.33 ± 18.88% vs GCC: 50.36 ± 8.07% y GP: 30.85 ± 21.98% vs GCP: 60.46 ± 7.31%). Paralelamente, se aislaron las células de Sertoli del grupo de células testiculares empleando la lectina DSA y se cultivaron en medio DMEM + 10%SBF. Una vez alcanzado el 90% de confluencia, éstas se co-cultivaron con las SSC enriquecidas en medio DMEM. En los primeros tres días se observó un rápido crecimiento de las SSC en contacto con las células de Sertoli y la formación de quistes sincitiales de SSC luego de aproximadamente dos semanas, lo que no se observó en los cultivos de células madre espermatogoniales enriquecidas sin células de Sertoli. Del presente estudio se concluye que el empleo de las gradientes de Percoll es un buen método de enriquecimiento de SSC y el co-cultivo con células de Sertoli es capaz de promover la proliferación de las SSC en cultivos de corto plazo.