Caracterización estructural y funcional de la pictobina, una enzima similar a trombina del veneno de la serpiente peruana Bothrops pictus “jergón de la costa”

Abstract

Describe la purificación y caracterización bioquímica, estructural y funcional del principio coagulante del veneno de la serpiente endémica del Perú Bothrops pictus, denominada pictobina. La enzima es purificada por la combinación de tres pasos cromatográficos, empleando intercambio catiónico CM-Sephadex C-50 seguida de dos pasos de filtración molecular en Sephadex G-100 y Sephadex G-75 respectivamente. La Pictobina es una glicoproteína monomérica con una masa molecular de 49 kDa medida por PAGE-SDS bajo condiciones reductoras y de 41 kDa por MALDI-TOF-TOF. El contenido de carbohidratos es de aproximadamente 45% de la masa y pueden ser removidos por deglicosilación con PNGasa F. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25.76%), hexosaminas (13.12%) y ácido siálico (0.76%). La secuencia N-terminal (VIGGDECNINEHRFLAFTYS) muestra semejanza con las enzimas similares a trombina. La Pictobina tiene actividad coagulante sobre plasma humano y fibrinógeno humano y bovino. La actividad coagulante específica de la enzima es equivalente a 131.1 NIH U/mg de trombina liberando solo el fibrinopéptido A del fibrinógeno humano y tuvo un efecto defibrinogenante en roedores. La enzima produce una malla de fibrina porosa visualizada por microscopía electrónica de barrido, así como agregación plaquetaria. La Pictobina posee actividad catalítica sobre los sustratos sintéticos BApNA, S-2266, S-2302, S-2160 y S-2238. El tripéptido sintético D-Val-Leu-Arg-pNa el cual es considerado como el mejor sustrato. La actividad amidolítica es inhibida por PMSF, DTT y 2-β mercaptoetanol. La enzima muestra estabilidad a diferentes temperaturas (25 a 55°C), valores de pH (5.0 a 11.0) o en presencia de iones (Mg+2, Mn+2, Ca+2, Na+ y K+) pero es inhibida por el Zn+2. La enzima interacciona con el inhibidor endógeno α:2-macroglobulina y con el suero antibotrópico polivalente. La deglicosilación de la enzima produjo alteración en la actividad y el reconocimiento del antiveneno. El cDNA de la Pictobina (760 pb) codifica una proteína madura de 233 aminoácidos que conserva dominios estructurales con otras enzimas similares a trombina como el sitio catalítico (His40, Asp89 y Ser179) y los sitios de unión a sustrato S1, S2 y S3. Se identifican tres motivos para la N glicosilación. El modelamiento de la Pictobina revela un plegamiento tipo quimotripsina presentando un bolsillo hidrofóbico sobre su superficie, involucrado en el reconocimiento del sustrato y un importante bucle 90’s clave en la restricción del sitio catalítico. Los análisis de interacción molecular revelan que los residuos Phe194 y Trp195 de la Pictobina forman una interacción estable con los residuos Gly13, Gly14 y Val15 del fibrinopéptido A posicionando el puente de los residuos Arg16 y Gly17 del sustrato para el clivaje en el sitio catalítico. Tomando en conjunto estos resultados, se concluye que Pictobina es una enzima similar a trombina presente en el veneno de la serpiente Bothrops pictus.