Detección molecular de secuencias nucleotídicas con alto contenido de citosinas en el gen FMR1

Abstract

Varios microsatélites inestables se caracterizan por la presencia de nucleótidos de citosinas en sus unidades de repetición; adoptan estructuras de DNA alternativas a la convencional y en algunos casos, involucran procesos de metilación. El genotipado de tripletes por PCR convencional se fundamenta en la denaturación del DNA y posterior amplificación del triplete repetido. Sin embargo, debido las estructuras alternativas que adoptan estos microsatélites, las reacciones de denaturación y amplificación son ineficientes.

En este trabajo desarrollo una alternativa de diagnóstico por PCR para secuencias ricas en citosinas (metiladas y no metiladas) basada en modificación nucleotídica. Previo consentimiento se modificó el gen del retardo mental ligado al fragilidad del cromosoma X tipo 1,cuya siglas en ingles es FMR1(Fragile X Mental Retardation 1) de ocho individuos normales (cuatro mujeres y cuatro varones) empleando bisulfito de sodio, cambiando las citosinas en uracilo. Posteriormente, con el uso de bioinformática, se realizó:1) La simulación de las estructuras alternativas que adopta el microsatélite inestable contenido en la región 5’-UTR del gen. 2) Luego de la ubicación de las islas CpG, se generaron cebadores específicos que hibriden con el microsatélite modificado (Primer T) y cebadores específicos que hibriden con una secuencia modificada del gen FMR1 que contiene las islas CpG (Primer M). Finalmente, ambas secuencias fueron amplificadas por PCR convencional.

La modificación del DNA fue evidenciada por espectrofotometría al uracilo, luego de tratamiento químico con bisulfito de sodio. La estructura que fue evidenciada por métodos bioinformaticos fue la estructura llamada hairpins (Horquillas). Se encontraron dos potenciales islas CpG en la región estudiada. La amplificación con los cebadores T confirmó el diseño in silico desarrollado para abordar la estructura en hairpins y el efecto que ejerce la modificación sobre este tipo de estructura. La amplificación con los cebadores M permitió detectar metilación de la primera isla CpG del gen FMR1 en el cromosoma x inactivo.

En conclusión se desarrolló un método alternativo para amplificación de secuencias de microsatélite en rango normal, que contengan citosinas metiladas y no metiladas, que permite la amplificación mediante PCR. Se requieren estudios posteriores con muestras de DNA que contengan microsatélites anormalmente expandidos (metilados y no metilados) para validar su aplicación clínica diagnóstica.

-- Palabras clave: metilación, modificación nucleotídica, tripletes repetidos

-- Many unstable microsatellites are characterized by presenting cytosine nucleotides in their repeat units, adopting alternative DNA structures and, in some cases, are involved in methylation processes. Triplet sequences genotyping by PCR methodology is based on DNA denaturation and amplification of the unstable microsatellite. However, due to alternative structures adopted by microsatellites, denaturation and amplification processes are inefficient. This thesis developed an alternative PCR genotyping method for cytosine rich sequences (methylated and unmethylated) based on nucleotide modification.

After appropriate informed consent, the FMR1 gene from 8 healthy subjects (four male and four female) was modified with sodium bisulfite. Subsequently, using bioinformatics tools, we performed: 1) simulation of alternative structures of the unstable microsatellite in the 5’-UTR region of the gene. 2) After localization of the CpG islands, we generated specific primers which hybridize with the modified microsatellite (Primers T) and specific primers that hybridize to a new sequence of the FMR1 gene containing CpG islands (Primers M). Finally, both of these sequences were amplified by PCR.

Modified DNA was obtained after chemical treatment with sodium bisulfite. Alternative structures of the sequence of the microsatellite were characterized. CpG islands of the gene, that can be methylated, were identified. Amplification confirmed expected results obtained previously by bioinformatics analysis. The T primers amplified the modified microsatellite of the FMR1 gene. The M primers amplified the modified sequence containing the CpG Island of the gene.

In conclusion, we developed a potential alternative genotyping method for amplification of microsatellite sequences carrying methylated and unmethylated cytosine Further studies are needed in DNA samples from individual with abnormally expanded microsatellites both methylated and unmethylated to validate clinical application.

-- Key words: methylation, nucleotide modification, triplet repeats