Estudio de la transfección del vector pEGFP-N1 y su expresión transitoria en un cultivo de hemocitos del langostino Litopenaeus vannamei

Abstract

Estandariza la transfección de un cultivo de hemocitos de langostino blanco con el vector de expresión pEGFP-N1 aplicando dos cantidades: de 2 μg y 4μg de plásmido, así como 2 tiempos de exposición: 12 y 24 horas. La realización de la transfección requirió de una amplificación previa del plásmido utilizando la cepa de E. coli DH5α en la que se clonó y luego se confirmó mediante amplificación por PCR obteniendo un amplicón característico de 860 pb. Posteriormente, los productos se purificaron, alcanzando altas concentraciones de plásmido y fueron agregados en cultivos primarios de hemocitos utilizando el medio L15 e incubándolos a 28°C. Luego se realizaron las evaluaciones de citotoxicidad producida por la transfección en los hemocitos a diferentes tiempos, así como la presencia del plásmido dentro de las células y la expresión del gen EGFP. Los valores de viabilidad del tratamiento con 2 μg de plásmido por 12 horas de exposición tuvieron mayor similaridad con aquellos mostrados en el tratamiento control, los demás tratamientos mostraron valores reducidos de viabilidad. En todos los tratamientos la viabilidad fue disminuyendo en el tiempo hasta alcanzar valores cercanos al 2%. La presencia del plásmido no pudo ser determinada correctamente en la mayoría de las muestras, sin embargo se detectó hasta las 60 horas después de la transfección. Al analizar la expresión del gen reportero EGFP obtenida de los hemocitos transfectados y el control se obtuvo el valor más alto entre las 48 y 60 horas, distinguiéndose al tratamiento de 2 μg por 12 horas por poseer una mayor expresión que los demás tratamientos, mas no fue un dato significativo, a su vez no se registró expresión en las muestras control. En conclusión la metodología utilizada fue efectiva ya que se encontró la expresión del gen reportero, además se podría considerar el tratamiento de 2μg por 12 horas como el más efectivo de los 4 evaluados debido a su mayor expresión genética y una menor citotoxicidad comparado con los demás tratamientos.