Efecto de la Neomicina B sobre la transcripción y replicación del Rotavirus tipo A

Abstract

Se ha demostrado que los antibióticos aminoglucósidos interactúan con varias moléculas de ARN al unirse a regiones con estructuras secundarias. Varios reportes indican que la neomicina B puede inhibir la replicación del VIH y otros virus ARN. El genoma rotaviral consiste de 11 segmentos de ARN de doble hebra, la replicación viral emplea ARN cadena positiva (ARNm) como templado para la síntesis de ARN de cadena negativa. Se ha determinado que señales existentes en cis del ARNm son necesarias para la replicación al involucrar secuencias y conformaciones esenciales para el reconocimiento de la polimerasa viral. Debido a que se requieren dos pasos para la síntesis de ARN para la morfogénesis del virus, se ha estudiado los efectos de neomicina B y otros aminoglucósidos en la transcripción y/o replicación del genoma viral. Los resultados demuestran que neomicina B a concentraciones de 3mM inhiben la replicación in vivo de rotavirus en células MA104. Se determinó que neomicina B a concentraciones de 125μM logra casi 100% de inhibición en los “open core” donde se observa tanto transcripción y síntesis de cadenas negativas (síntesis de ARN de doble hebra). El estudio de la naturaleza de la inhibición mostró que los 11 segmentos del genoma viral tenían una sensibilidad diferencial a la droga, siendo los segmentos 2, 3 y 4 más sensibles. El sistema “open core” permitió la síntesis de cadenas negativas usando ARNm de rotavirus exógeno como templado. En experimentos donde se adicionó neomicina, se obtuvo una inhibición total de la síntesis de cadenas negativas dependientes del templado exógeno sobre la síntesis endógena. Se estudió el efecto de neomicina en la transcripción (síntesis de cadena positiva) en un sistema in vitro; donde concentraciones de 12mM resultaron completamente inhibitorias afectando el inicio y elongación de los 11 segmentos genómicos, observado mediante una estrategia de pulso y cacería (“pulse and hunting”) y electroforesis en gel de poliacrilamida-urea al 30%. Una prueba de protección del RNA a la acción de enzimas nucleasas permitió determinar la interacción neomicina-ARNm viral. Estos resultados indican que la neomicina B interactúa tanto con ARN una hebra como con ARN doble hebra de los rotavirus, pero tiene mayor afinidad por ARN una hebra produciendo inhibición de la replicación. La afinidad diferencial para ambos ARN podría explicarse mediante la presencia de ARNm rotaviral en el sitio de unión a neomicina, similar a la presente en TAR RNA del VIH, uniéndose a secuencias y/o estructuras secundarias en el ARNm previniendo que el ARN viral polimerice la síntesis de ARN hebra simple. -- Palabras claves: Rotavirus, aminoglucósidos, neomicina, transcripción viral, replicación viral.

-- The aminoglycosides antibiotics have been shown to interact with various RNA molecules binding to regions with secondary structure. Reports indicate that neomycin B may inhibit the replication of HIV and other RNA viruses. The rotavirus genome consists of 11 segments of double-stranded RNA, viral replication uses as template the plus-strand RNA (mRNA) for minus-strand RNA synthesis. Has been determinate that existent signals in cis in the mRNA necessaries for the replication that involvement sequences and conformations essential for the recognition the polymerase viral. Since two different RNA synthesis step are involve in the morphogenesis of the virus the effect of neomycin B and other aminoglycosides was studied in both transcription and/or replication of the viral genome. The results show that concentrations of 3 mM of neomycin B inhibited the rotavirus replication in vivo on MA104 cells. In open cores where both transcription and minus strand synthesis (double stranded RNA synthesis) could be observed, it was determined that near a 100% inhibition was obtained with concentration 125 μM neomycin B. The study of the nature of the inhibition showed that the 11 segments of viral genome had a differential sensibility to the drug, segment 2, 3, 4 and 5 were more sensitive. The open core system allowed minus strand synthesis using as template exogenous rotavirus mRNA. In experiments where neomycin B was added, a total inhibition of the minus strand synthesis dependant of the exogenous template was obtained over the endogenous synthesis. The effect of neomycin in transcription (plus strand synthesis) was studied in vitro system; concentrations of 12 mM were fully inhibitory affecting the start and elongation of 11 genomic segments, observed by pulse and hunting strategy and poliacrylamide –urea gel 30% electrophoresis. Protection a nuclease test allowed to determined interaction neomycin –viral mRNA. These results indicate that the neomycin B interacts with single strand RNA as well as double strand RNA of rotavirus, but has highest affinity for single strand RNA producing inhibition of replication. The differential affinity for both RNA could be explain by the presence in rotavirus mRNA of a neomycin binding site, similar to the one present in TAR RNA of HIV, binding to a sequence and/or secondary structure in the mRNA preventing than the viral RNA polymerize synthesis of minusstrand RNA. -- Key words: Rotavirus, viral transcripción, viral replicación, aminoglycósides, neomycin