Caracterización bioquímica y estructural de una enzima fosfolipasa A2 del veneno de la serpiente peruana Bothrops pictus “Jergón de costa”

Abstract

Purifica la isoforma ácida presente en el veneno de Bothrops pictus mediante el uso de dos pasos cromatográficos: CM Sephadex C-50 seguido de Superdex 75 10/300 GL, lográndose un rendimiento de 7.5% y un factor de purificación de 19.8 veces. Se obtiene una sola banda con un peso molecular de 16.6 kDa en condiciones reductoras y 15.2 kDa en condiciones no reductoras empleando la técnica de PAGE-SDS. Se determina el peso molecular en solución mediante la técnica de dynamic light scattering obteniéndose una única población de proteínas monodispersa de radio hidrodinámico de 4.254 ± 0.778 (nm) correspondiente a un peso molecular de 19.7 ± 3.7 kDa. La enzima BpicPLA2ácida es altamente termoestable debido a que mantiene casi intacta su actividad incluso después de incubarla por 10 min a 100 ⁰C. El ion que incrementa en mayor medida su actividad es el calcio y el agente con mayor inhibición es el ditiotreitol. Los estudios de dicroísmo circular demostraron que la estructura secundaria predominante en la BpicPLA2ácida son las α hélices. La secuencia de aminoácidos de BpicPLA2ácida tomada del GenBank muestra la presencia de un sitio catalítico (His48, Asp49, Tyr52 y Asp99) conservado, mientras que el sitio de unión a calcio no es completamente conservado, debido a una mutación en la posición 28 de la tirosina por fenilalanina. El modelo de la estructura tridimensional reportado, demuestra que la isoforma BpicPLA2ácida es una enzima que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 de la clase II y que además presenta una mayor relación evolutiva con otras PLA2 ácidas.