Producción de la glicoproteína G recombinante del virus de la laringotraqueitis infecciosa aviar utilizando el sistema de expresión de baculovirus en células de insecto

Abstract

El virus de la laringotraqueitis infecciosa (VLTI) es responsable de una importante enfermedad respiratoria en aves. La glicoproteína G (gpG) es un factor de virulencia en el VLTI, identificada como una proteína viral de unión a quimioquinas (CKBP) capaz de unirse a quimioquinas de aves y de otras especies modulando su actividad. Esto hace de la gpG una proteína de interés científico y comercial, requiriéndose, por lo tanto, tener suficiente cantidad de proteína disponible para futuros estudios funcionales y estructurales. Se describe un método para la producción de gpG recombinante del VLTI en un biorreactor de tanque agitado, infectando la línea celular de Spodoptera frugiperda Sf-9 con el baculovirus BV-gpG. Para este fin, fue necesario una caracterización previa del crecimiento de las células Sf-9; a su vez, optimizar la producción de gpG a pequeña escala y finalmente, definir parámetros operacionales en el biorreactor Biostat B plus que aseguren un ambiente hidrodinámico adecuado para el crecimiento e infección de las células. Las células Sf-9 mostraron una velocidad específica máxima de crecimiento (µmax) de 0,026/h, un tiempo de doblaje poblacional (TDP) de 27 horas y una densidad celular máxima de 8,7x106 cel/mL. A pequeña escala, la producción de gpG fue mayor al cosechar las células a las 72 horas post infección (hpi) independientemente de la multiplicidad de infección (MOI) empleada en el rango de 1,2 a 20. Una mayor producción de gpG fue obtenida al infectar las células durante la fase de crecimiento exponencial temprana comparada a la fase de crecimiento exponencial tardía. La densidad óptima de infección varió en dependencia del empleo de medio condicionado (2x106 cel/mL) o de medio fresco (7x106 cel/mL). En el manejo del biorreactor, se observó que el empleo de una velocidad de agitación de 170 rpm, una tasa de aireación de 0.04 vvm y un valor de pO2 de 40%, mostraron que las células Sf-9 no fueron sensibles a un estrés de corte de 0.38 N/m2 a un valor de número de Reynolds alto (20x104) en condiciones de aireación por sparger. Una eficiente producción de gpG en 3,5 L de biorreactor fue lograda infectando el cultivo en fase de crecimiento exponencial, a una densidad de 2x106 cel/mL, un MOI de 2 y cosechado a las 72 hpi. Mediante un ELISA sandwich se logró cuantificar el rendimiento volumétrico de gpG his, el cual fue de 3.66 mg/L, lo que representa un aumento de 2 fold comparado a la producción en el matraz. Los resultados demuestran la factibilidad de producir glicoproteína G en células de insecto infectadas con un baculovirus a escala de biorreactor.