Optimización de la actividad proteolítica de Bacillus sp., aislados de suelo de cultivo en Huacho - Perú

Abstract

Objetivo: Optimizar la actividad proteolítica de cepas de Bacillus sp., extraídos de tierras de cultivo en Huacho – Perú. Metodología: Se procedió a recolectar muestras de suelos de cultivos de forma aleatoria, las muestras tuvieron aproximadamente 200g de tierra, Desde una distancia inicial de 5 cm de la superficie del suelo, se realizó una excavación adicional de 10 cm para obtener la segunda muestra. Se extrajo 1 gramo de suelo de la muestra recopilada, seguido de diluciones seriadas en solución salina estéril hasta alcanzar una dilución de 10-4 . Posteriormente, se llevó a cabo un shock térmico a 60°C durante 30 minutos para obtener esporas puras, las cuales se sembraron en la superficie de Agar Nutritivo en volúmenes de 0,1 ml. Las placas se llevaron a incubación a una temperatura de 37°C por un tiempo de 48 horas. Después de la incubación, se examinaron las colonias en el agar, seleccionando aquellas con características microscópicas sospechosas de Bacillus sp. y realizando una tinción Gram. Por último, la actividad proteolítica fue activada mediante un proceso de inducción en las cepas aisladas. Para ello, estas cepas se sembraron en Leche descremada ultra light 1% + Cloruro de Calcio 0.5 g/L en placas Petri mediante a la técnica por picadura y paso a incubación. Se realizó lecturas del halo cada 24 horas. La producción de proteasas a nivel laboratorio en la cual se utilizaron dos matraces de vidrio de 1L. Luego se le agregaron 70 ml del inóculo (6 x 108 UFC/ml) y se puso en funcionamiento y se incubaron. Se extrajeron 8 ml de la muestra del matraz cada 24 horas, después de la recolección, se llevó a cabo un centrifugado a 3000 rpm en un tiempo de 15 minutos En el sobrenadante resultante, se procedió a cuantificar en relación con el periodo de incubación las unidades de proteasas fabricadas. La medición de la actividad enzimática de las proteasas se realizó añadiendo 2 ml de solución de caseína al 1.5% (pH 8) junto con 2 ml de sobrenadante a un tubo de ensayo. La mezcla se pasó a incubar a 37°C en un tiempo de 60 minutos. Posteriormente, se detuvo la reacción agregando 2,5 ml de Ácido Clorhídrico (0,1 N), seguido de una centrifugación a 3000 rpm durante 15 XIV minutos a la intemperie. Por consiguiente, se combinaron 2 ml de reactivo de Biuret con 2 ml de sobrenadante en tubos de ensayo. Tras una mezcla breve de 10 segundos, la solución fue llevada a cuartos oscuros durante 30 minutos y a una longitud de onda de 540 nm se midió la absorbancia. La cantidad de proteasas producidas fue analizada por medio de un examen estadístico de Análisis de Varianza (ANOVA) con un nivel de significancia del 0.05% para determinar la presencia de diferencias significativas. Resultados: Se aislaron 11 bacterias de las zonas muestreadas con características morfológicas de Bacillus. Las características de las colonias obtenidas presentaron forma circular, color crema y de consistencia gomosa en la mayoría de los casos, y la mayoría se presentan como bacilos Gram positivos creadoras de endospora. Las cepas que tuvieron mejor tamaño de halo luego de las 24h de incubación en el medio empleado fueron las de MP11 con 1.16 cm y la MS17 con 1.1 cm, estas fueron seleccionadas para la siguiente prueba de cuantificación de proteínas. La producción de proteasas a nivel laboratorio en la cual se seleccionaron las dos mejores cepas (MP11 y MS17) para producir la proteasa a nivel laboratorio en el medio líquido ya descrito y su respectivo control. La medición de la actividad enzimática de proteasas. Las muestras de las proteasas fueron cuantificadas teniendo como resultados mejores valores que el control positivo. Conclusiones: Se aislaron microorganismos del género Bacillus fabricadoras de proteasas, procedentes de campos de sembrío de la UNJFSC. Los aislado bacteriano Gram positivos codificados como MP11 y MS17, resalto por producir un diámetro de halo de hidrólisis de MS17 1.1milimetros y MP11 1.6 milímetros