Influencia de las mutaciones del gen pncA de cepas de Mycobacterium tuberculosis multidrogoresistentes sobre los parámetros cinéticos y actividad enzimática de Pirazinamidasas recombinantes

Abstract

La pirazinamida es un profarmaco que al ingresar a Mycobacterium tuberculosis (Mtb) y mediante la acción de la pirazinamidasa (PZAsa), enzima codificada por el gen pncA, es convertida a su forma activa, el ácido pirazinoico (POA) el cual es un tóxico y potencial inhibidor de micobacterias en estado de latencia. Las mutaciones en el gen pncA constituyen el principal mecanismo de resistencia a PZA. En este estudio, se evaluó la influencia de las mutaciones del gen pncA de cepas de Mtb multidrogoresistentes sobre los parámetros cinéticos y actividad enzimática de PZAsas recombinantes a través de técnicas de clonamiento molecular y expresión de proteínas recombinantes. Para ello, se trabajó con mutaciones (G373T, T515C, G511A y G185A) que en la estructura de las PZAsas recombinantes dan lugar a cambios de aminoácidos (V125F, L172P, A171T y P62L) alejados de los sitios catalíticos. Nuestros hallazgos de acuerdo a los análisis estadístico muestran que las mutaciones no afectaron los valores de 𝐾𝑚 (p>0.05), sin embargo, los demás parámetros cinéticos (𝐾𝑐𝑎𝑡 y 𝐸𝑓𝑓) y actividad enzimática (p<0.05) sí fueron afectados. La PZAsa con el cambio de aminoácido L172P mostró una funcionalidad (𝐾𝑐𝑎𝑡: 11 𝑚𝑖𝑛−1; 𝐸𝑓𝑓: 8.24 𝑚𝑖𝑛−1𝑚𝑀−1; actividad enzimática: 0.51 μ𝑚𝑜𝑙 𝑃𝑂𝐴∗𝑚𝑖𝑛−1∗𝑚𝑔−1𝑃𝑍𝐴𝑠𝑎) mucho menor al de las otras PZAsas y acuerdo al análisis de Tukey al compararse con la PZAsa WT H37Rv se evidenció este orden: WT H37Rv > V125F > A171T > P62L > L172P. En conclusión las mutaciones del gen pncA afectan negativamente los parámetros cinéticos (𝐾𝑐𝑎𝑡 y 𝐸𝑓𝑓) y actividad enzimática de PZAsas recombinantes.