Estandarización de la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección de Leishmania (V) peruviana y Leishmania (V) braziliensis. Ayacucho 2009.

Abstract

El presente estudio se desarrolló en el Centro de Investigación en Biología Molecular y Bioinformática de la UNSCH, planteándonos como objetivo general, estandarizar la técnica molecular de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la detección de Leishmania (V) peruviana y Leishmania (V) braziliensis y objetivos específicos, realizar los cultivos in vitro de Leishmania, obtener ADN de buena calidad de pureza de estos hemoparásitos y determinar las condiciones físicas, concentraciones y volúmenes de los componentes del PCR para la amplificación del segmento de ADN del minicírculo del kinetoplasto de Leishmania. Las cepas de Leishmania fueron cultivadas y mantenidas en medio bifásico a 28 ºC por 4 ó 6 días, se extrajo el ADN con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), se cuantificó cualitativamente y cuantitativamente el ADN y se procesó el PCR probando diferentes concentraciones de los componentes y las temperaturas de hibridación. Con los resultados, llegamos a determinar que las condiciones adecuadas en la preparación del mix para una reacción fue: Buffer 1X, MgCl? 2 mM, dNTP 0,2 mM, primer 13A 1,0 µM, primer 13B 1,0 µM, Taq polimerasa 1 U/µL, agua (NFW), ADN (200 ng/µL) 2,0 µL, volumen final de 25 µL; el ciclaje fue: desnaturalización inicial (96 ºC por 3 minutos), 30 ciclos (96 ºC por 1 minuto, 52 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 2 minutos) y una extensión final (72 ºC por 6 minutos). Con estos resultados llegamos a determinar las condiciones físicas y químicas que nos permitieron obtener productos de PCR que se evidenciaron por la presencia de una banda de 120pb bastante nítida, compacta y muy resplandeciente luego de la tinción con bromuro de etidio expuesto en el transiluminador con UV.