Obtención de variantes de ferritina de soya con selectividad para cadmio mediante clonación y mutagénesis in vivo en Saccharomyces cerevisiae

Abstract

La ferritina es una proteína multimérica que almacena miles de iones férricos en numerosos organismos. A pesar de estar ausente en Saccharomyces cerevisiae, esta levadura es capaz de producir ferritinas heterólogas funcionales, como la subunidad H1 de la soya (sH1). Su selectividad hacia el hierro se basa en la actividad ferroxidasa, lo que permite la oxidación de iones ferrosos y su posterior almacenamiento. Asimismo, esta proteína también exhibe afinidades con el cadmio, y ejemplos importantes son las ferritinas de arveja y de caballo. Una comparación de las secuencias aminoacídicas de estas ferritinas permitió identificar una región que podría ser responsable de las diferentes especificidades. Por tanto, este estudio tuvo como objetivo producir en S. cerevisiae variantes de ferritina de soya con aumentada selectividad para cadmio. Por un lado, se incorporaron en sH1 dos aminoácidos de la secuencia de caballo y cinco de la de arveja, logrando la producción de la variante sH1hp en levadura, confiriendo una mayor resistencia al cadmio. Logrado esto, la región de cinco aminoácidos se sometió a mutagénesis aleatoria. La estrategia de clonación in vivo permitió la construcción eficiente de una biblioteca de plásmidos y la expresión inmediata de las variantes en S. cerevisiae. El tamizado de los transformantes obtenidos permitió identificar la variante sH1trc, que permitió el crecimiento de los transformantes en medios suplementados con cadmio. Además, para reducir la afinidad de las variantes de ferritina hacia el hierro, se mutaron los aminoácidos responsables de la actividad ferroxidasa. Finalmente, los extractos de proteína termoestable se sometieron a análisis por SDS-PAGE y cuantificación de cadmio. Se verificó así la producción de variantes de ferritina termoestables y que las variantes que carecían de actividad ferroxidasa tenían el mayor contenido de cadmio. En consecuencia, se logró una remoción de cadmio de hasta el 80 por ciento con estas variantes.

Ferritin is a multimeric protein that stores thousands of ferric ions in numerous organisms, but one important exception is Saccharomyces cerevisiae. However, this yeast can produce high levels of functional heterologous ferritins, such as the soybean H1 subunit (sH1). Iron selectivity is based on ferroxidase activity, which allows the oxidation of ferrous ions and their eventual efficient storage. Likewise, this protein also exhibits affinities to other metal ions such as cadmium, important examples being pea and horse ferritins. A comparison of the amino acid sequences of these ferritins allowed the identification of a region that might be responsible for the different specificities. Therefore, this study aimed to produce soybean ferritin variants with increased cadmium selectivity in S. cerevisiae. On the one hand, two amino acids from horse ferritin and five from pea ferritin were incorporated into sH1, achieving the production of the sH1hp variant in yeast cells, which exhibited a greater resistance to cadmium. Once this was achieved, the five amino acid region was subjected to random mutagenesis. The in vivo cloning approach allowed the efficient construction of a plasmid library and the immediate expression of the variants in S. cerevisiae. The screening of the yeast transformants obtained allowed the identification of the sH1trc variant, which allowed the growth of the yeast transformants in media containing high concentrations of cadmium. Furthermore, to reduce the affinity of the ferritin variants towards iron, the amino acids responsible for the ferroxidase activity were also mutated. Finally, the thermostable protein fractions were subjected to analysis by SDS-PAGE and quantification of cadmium. With these assays, it was verified the production of thermostable ferritin variants and, in addition, that the variants that lacked ferroxidase activity had the highest cadmium content. Consequently, cadmium removal of up to 80 per cent was achieved with these variants.