Evaluación de cuatro tiempos de cultivo sobre la tasa de maduración y división pos fecundación In vitro, de ovocitos de alpaca procedentes de camal

Abstract

Evalúa el efecto del tiempo de incubación sobre la maduración nuclear y determinar la tasa de división de ovocitos madurados y fecundados a las 72 horas post fecundación. Complejos Cumulos–Ovocitos (CCOs) fueron obtenidos de ovarios procedentes de animales sacrificados y transportados al laboratorio en un termo conteniendo solución salina 0.9% suplementada con antibiótico antimicótico a 35°C. CCOs fueron aspirados de folículos = 6mm. Previo a la evaluación en un estéreomicroscopio, 502 ovocitos fueron distribuidos en los 4 tiempos de Maduración: 30, 34, 38 y 42 horas, 533 ovocitos fueron cultivados y fecundados después de ser madurados a las 30, 34, 38 y 42 horas. CCOs con dos o más capas de células fueron madurados en medio TCM-199 suplementado con 10% SFB, 0.5µg/mL de FSH, 10µg/mL de hCG, 0.2mM de Piruvato de sodio, 50µg/mL de gentamicina y 1µg/mL de estradiol, colocado en aceite mineral y cultivados a 39ºC bajo una atmosfera de 5 % de CO2 y alta humedad. Después del tiempo de maduración, los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con 10% de SFB y 1mg/ml de hialuronidasa y fijados en una solución de etanol: acido acético (3:1). Ovocitos fueron colocados en una lámina y teñidos con 1% de orceína. Las láminas fueron examinadas bajo un microscopio de contraste de fases a 400X para evaluar el estado de maduración nuclear y clasificarlos como Metafase I (MI), Vesícula Germinal (VG), Anafase – telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación, ovocitos fueron madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de testículos procedentes de centros de sacrificio. Espermatozoides motiles fueron obtenidos por centrifugación a 700g bajo una gradiente de Percoll discontinua (22.5:45%) por 25 minutos. El sobrenadante fue removido y el pellet reconstituido con TLStock. Espermatozoides y ovocitos madurados fueron co-cultivados por 18 – 20 horas a 39ºC con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM suplementado con 10% de SF, 2mM de piruvato de sodio y 50µg/mL gentamicina y evaluados a las 72 horas. En el experimento 1, la proporción de ovocitos que alcanzaron el estadío de M-II fueron 26.3; 53.6; 62.6 y 74.4 % para las 30, 34, 38 y 42 horas de cultivo respectivamente, con diferencia estadística entre los G-I y II respecto al GIII y C-IV (p<0.05). En el experimento 2, las tasas de división fueron 9.5; 7.7; 15.4 y 19.2 para 30, 34, 38 y 42 horas de maduración después de 72 horas de cultivo. Estos resultados indican que es necesario de 38 a más horas de maduración In vitro de ovocitos de alpaca. Los resultados indican que se requiere de 38 a más horas para la maduración y fecundación In vitro de ovocitos de alpaca.